Cancer Cell ：蛋白质组学筛选AML细胞免疫治疗靶点
编者按：
CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，因其在治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）中取得的史无前例的成功而被公众熟知。急性髓细胞白血病（AML）是成人最常见的急性白血病，与其他癌症相比，AML具有较低的突变负荷(在确诊的患者中平均只有13个基因发生突变)。因此，通过编码序列突变发现潜在的新抗原并进行免疫识别的可能性较小。而以AML细胞表面上调的蛋白质作为靶点的嵌合抗原受体(CAR)治疗是一种潜在的治疗方法。
鉴于靶向CAR-T强大的杀伤能力，为了防止“误伤”，理想的治疗靶点不应该在任何正常的组织/器官上表达，且不能在CAR T细胞中表达。因此，不仅要在肿瘤细胞中评估候选靶点，并且需要在所有正常组织中仔细评估。
来自美国斯隆凯特林癌症纪念中心的研究人员运用高通量蛋白质组学等技术方法，结合细胞膜表面蛋白数据库，对细胞表面抗原进行全面的注释，进而筛选并评估AML的潜在靶点，确定了一种可以最大化识别AML而不增加对正常细胞毒性的组合靶向策略，研究发表在著名学术杂志Cancer Cell上。
1、AML表面分子注释综合数据集
研究人员基于高通量蛋白质组学和转录组学的方法，结合细胞膜表面蛋白数据库，对细胞表面抗原进行全面的注释，注释数据集如图1所示，共包含以下五个方面的内容：
图 1 AML表面分子注释综合数据集
1. AML Vs Control（橘色部分）：为找到AML细胞系中，对比正常组织细胞过表达蛋白，研究者通过质谱分析共鉴定4942个蛋白质。为了生成更具包容性的数据集,研究人员将其他髓系白血病细胞系的表面特异性蛋白质组研究的结果一并加入到鉴定结果中；
2.蛋白质亚细胞结构定位(黄色部分)：标注细胞膜上的分子；
3.正常组织细胞蛋白组（绿色部分）：为了注释这些分子在正常组织中的表达，研究人员整合了来自人类蛋白图谱(HPA)、人类蛋白组图谱(HPM)和蛋白质组数据库(PD)的数据；
4.AML与正常细胞mRNA组（粉色部分）：去除与正常细胞相比，AML细胞中未过度表达的表面分子；
5.候选靶点的表达情况（蓝色部分）：基于流式细胞仪的方法，分析30个原发性AML患者样本中候选靶点的表达情况。
2、原发性AML标本和正常造血细胞潜在靶点表达分析
通过数据集的注释和嵌合抗原受体靶点识别算法的设计，研究人员筛选在正常组织中低表达，在AML中过表达的24个分子作为候选靶点。
研究人员随后利用流式细胞仪检测30个AML原发标本中24个潜在靶点的表达水平。研究发现，其中9个潜在靶点(包括CD82，TNFRSF1B，ADGRE2，ITGB5, CCR1，CD96, PTPRJ，CD70和LILRB2)在所有样本的> 75%的细胞中发现（图2A）。由于理想的CAR靶点应该在白血病干细胞中表达，研究人员检测了AML 白血病干细胞中24个潜在靶点的表达情况，发现上述9个靶点在原发性AML细胞亚群中也高度表达(>75%)(图2B)。
图 2 原发性AML标本潜在靶点表达分析
正常造血干细胞（CD34+CD38CD90+CD45RA HSCs） 和CD34+CD38+祖细胞的数据显示，其中6个分子(TNFRSF1B、ADGRE2、CCR1、CD96、CD70和LILRB2) 在正常造血干细胞和祖细胞中低水平(<5%)表达 (图3C)。由于嵌合抗原受体疗法需要功能性嵌合抗原受体T细胞的持续活性，研究人员分析了这些抗原在健康捐赠者新鲜纯化并激活的T细胞中的表达，发现其中4个候选靶点在T细胞中表现出低水平的表达(图3D)。
图3 正常造血干细胞样本潜在靶点表达分析
综上，研究人员确定了4个潜在的嵌合抗原受体靶点：ADGRE2, CCR1, CD70和LILRB2。但是，这些靶点都没有表现出与CD19类似的特征：在几乎所有的B细胞白血病细胞中都高水平表达，而在正常造血干细胞和祖细胞及T细胞中完全不表达，所以促使研究人员利用注释的数据库来探索组合靶向策略。
3、运用注释数据库，探索组合靶向策略
配对的抗原组合(抗原A和抗原B)需要符合以下六个原则：
1.靶向/非肿瘤毒性最小化：两种抗原在正常组织中不表达或低表达；
2.造血干细胞毒性最小化：两种抗原在造血干细胞中低表达；
3.T细胞反应最小化：两种抗原在正常静止和活化的T细胞中低表达；
4.克服克隆异质性：两种抗原覆盖所有的肿瘤细胞；
5.抗原在白血病干细胞上表达；
6.防止阴性抗原引起的复发：两种抗原都应尽可能在肿瘤细胞中共同表达。
遵循这样的原则，研究者筛选出四种组合:ADGRE2+CD33、CCR1+CLEC12A、CD70+CD33、LILRB2+CLEC12A，在原发性AML样本中展开分析。研究发现，这四种组合的每一组组合抗原阳性率均超过单一抗原阳性率，并接近100%阳性(图4B)。在正常骨髓造血干细胞和祖细胞及外周血T细胞中，这四个组合的表达水平较低(图4 D)。从而研究人员确定了一种可以最大化识别AML而不增加对正常细胞毒性的组合靶向策略。
图 4 AML中潜在CAR靶点的组合表达分析
研究人员运用高通量蛋白质组学等方法，成功筛选AML细胞免疫治疗的组合靶向策略。
（1）首先，研究人员筛选在正常组织中低表达，在AML中过表达的24个分子作为候选靶点。
（2）通过分析原发性AML标本和正常造血细胞潜在靶点表达，确定了4个潜在的嵌合抗原受体靶点：ADGRE2, CCR1, CD70和LILRB2。
（3）最后研究者运用注释数据库，探索组合靶向策略，确定了一种可以最大化识别AML而不增加对正常细胞毒性的组合靶向策略，为CAR治疗AML指明方向。
本文研究思路清晰，阐述了如何应用蛋白质组学技术以及多组学技术，发现肿瘤特异性的新抗原，并以之作为肿瘤疫苗的新靶点。我们相信在未来的肿瘤免疫研究领域，蛋白质组学将提供科学研究的助推力，驱动科研与临床运用。
参考文献：
Perna F, et al. (2017). Integrating Proteomics and Transcriptomics for Systematic Combinatorial Chimeric Antigen Receptor Therapy of AML. Cancer cell .
更多阅读推荐
精准医学与蛋白组学
海量文献解读
行业前沿报导
长按二维码关注我们
本公众平台由全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者——景杰生物(PTM BIO)独家赞助，景杰生物专业提供常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，更能提供高灵敏度的修饰类抗体，满足各类研究需求。
景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。