蛋白质组学与疾病生物标记物的筛选鉴定
生物标志物（Biomarker）是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。
蛋白质是执行生物学功能的活性生物大分子，和传统方法相比，蛋白质组学能够更直接地鉴定到病人和正常人之间差异表达的蛋白，成为发现生物标志物的重要途径。
从CNS等学术期刊中，我们也发现越来越多的蛋白质组学研究人员开始采用高通量技术不断发现疾病生物标志物，为此，我们在“行业精选”板块下新增了“标记物筛选”专题，也整理了部分典型的运用案例，以飨读者。
案例一：临床唾液样本中筛选牙周病的生物标志物
案例二：血清外泌体中筛选胆管癌生物标志物筛选
案例三：血清样本中筛选慢性移植物抗宿主病生物标记物
案例四：磷酸化组学揭示黑色素瘤生物标志物
案例五：蛋白质组学筛选神经退行性疾病蛋白标志物
案例六：弥漫型胃癌的分子分型与生物标志物筛选
牙周病是指发生于牙齿周围组织的疾病，是常见的口腔疾病。本病在早期多无自觉症状，且缺乏有效的分子诊断手段，因此该病的早期诊断仍然具有挑战性。唾液是一种无创性临床样本，包含有价值的临床相关生物标记物，如果有效利用可以促进早期疾病的诊断和监测。
研究对象：67例 临床唾液样本
疾病：牙周病（慢性牙周炎CP，侵袭性牙周炎AP，牙龈炎G）
期刊：Molecular & Cellular Proteomics
影响因子：6.540
技术路线
研究结果
研究者通过label-free定量蛋白组学分析，对67例临床唾液样本，包括17例慢性牙周炎(CP)患者唾液，17例侵袭性牙周炎(AP)患者唾液，17例牙龈炎(G)患者唾液以及16例健康人(H)唾液进行研究分析。结果共鉴定到486个蛋白，运用富集分析等技术，挑选富集程度排名前十的通路蛋白作为候选标志物。
随后研究者利用蛋白质靶向定量技术，对82例临床样本，其中AP (n=21)，CP (n=21)，G (n=20)，H (n=20)进行了靶向验证。最终成功在75例唾液样本中定量到60个蛋白，定量成功率达92%。对差异蛋白进行ROC曲线及曲线下面积(AUC)统计分析，筛选得到12个标志物蛋白对牙周疾病具有很好的指示作用。
图1潜在标志物蛋白的协同系数与使用频率分析
胆管癌（CCA）是恶性度较高的消化系统肿瘤。因其发展隐蔽且临床症状及体征出现晚，故给早期诊断带来困难。原发性硬化性胆管炎（PSC）是导致胆管癌的主要原因之一。在非侵染时期，鉴定肝内的胆管癌及肝癌（HCC）是非常困难的。目前尚未有准确区分CCA，PSC，及HCC的生物标记物。
研究对象：134例 临床血清样本
疾病：胆管癌，胆管炎，肝癌
期刊：Hepatology
影响因子：13.246
技术路线
研究结果
研究者选择43例胆管癌，30例胆管炎，29例肝癌患者与32例正常人的血清样本，运用蛋白质组学分析鉴定样本外泌体中的差异表达蛋白，分析发现胆管癌中VNN1, CRP, FIBG, IGHA1, A1AG1 and GGT1 这6个蛋白的表达量显著高于其他的三个样本，其中CRP蛋白显示出较高的诊断价值。
随后，研究者异种移植CCA，通过蛋白质组学分析小鼠血液外泌体，从中鉴定到23个人类的蛋白，证明肿瘤的外泌体可以分泌到血液中。说明血清EV中发现的CRP蛋白等新型标志物蛋白质，具有作为诊断工具的潜在应用价值。
图2 胆管癌蛋白生物标志物筛选
慢性移植物抗宿主病（cGVHD）是在同种异体的造血细胞移植（allo-HCT）后出现的主要并发症，发生率占移植病人的30-50%，同时它也是造成术后存活2年以上病人非复发死亡(NRM)的主要原因。cGVHD受多种因素影响，导致管控变得复杂和困难，加上缺少有效的标志物，阻碍其及时诊断。
研究对象：6例 小鼠血清样本，226例患者血清样本
疾病：慢性移植物抗宿主病（cGVHD）
期刊：Blood
影响因子：15.132
研究结果
研究人员利用TMT标记定量蛋白质组学分析，在同系cGVHD小鼠血清中鉴定和定量到1046个蛋白，其中具有1.2倍以上差异的蛋白有56个，其中4个上调的蛋白：RAS、CRKL和CCL8和CCL9可作为潜在的cGVHD生物标志物。随后运用抗体中和和供体蛋白敲除实验，证明供体T细胞中CRK/CRKL蛋白对cGVHD的发展与维持起重要作用，表明CCL9（人中同源的为CCL15）可能是一个潜在的cGVHD诊断标志物。
研究人员通过ELISA标记蛋白质定量技术，检测了178例患有cGVHD的HCT病人，33例未患cGVHD的HCT病人及15个健康人中CXCL17，CCL15（鼠CCL9同源蛋白）和CRKL的浓度，结果显示CCL15的浓度在cGVHD病人中显著升高，证明了CCL15可以作为cGVHD诊断的生物标志物。
图3胆管癌蛋白生物标志物筛选
黑色素瘤（Melanoma）多由黑色素细胞所形成的痣或黑色素斑发生恶变而来，是最常见的皮肤三大恶性肿瘤之一，也是皮肤肿瘤中恶性程度最高的瘤种，容易出现远处转移，因此早期诊断和治疗因而显得尤为重要。以黑素细胞丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）为靶点的BRAF与MKK抑制剂联合疗法，是临床治疗BRAF V600突变转移性黑色素瘤的有效方法。然而肿瘤治疗中的药物抗性问题依旧是获得更好临床效果的一个障碍，开发新的抑制剂，采用多种药物联用的疗法有望成为临床治疗的有效策略。
研究对象：黑色素瘤细胞
疾病：BRAF V600突变转移性黑色素瘤
期刊：Molecular & Cellular Proteomics
影响因子：5.232
研究结果：
研究者以WM239A转移性黑色素瘤细胞为研究对象，运用SILAC定量蛋白质组学技术，分析了其分别在MKK1/2和ERK1/2抑制剂刺激下的磷酸化信号通路的差异变化。结果共鉴定到12805个可定量的磷酸化位点，对应3819个蛋白质，其中8390个位点可在两到三次重复中被定量，有398个磷酸化位点显著变化1.8倍以上。
生物信息学分析后发现：MKK1/2与ERK1/2 抑制剂调节的磷酸化反应具有比较高水平的重叠性，仅受一种抑制剂调节的磷酸化反应较少；21个磷酸化位点特异性仅受一种抑制剂的影响；最终找到82个潜在的新型的ERK作用靶标。
图4 磷酸化组学揭示黑色素瘤生物标志物
神经退行性疾病有阿尔茨海默病（AD），路易小体痴呆（DLB）和帕金森疾病痴呆（PDD），关于这类疾病还缺乏有效的生物标志物。近日在著名学术期刊BRAIN上发表文章，利用蛋白质组学研究脑组织中的突触蛋白，鉴定一些可能成为疾病诊断的生物标志物，有助于早期预测和诊断该疾病的发生。
研究对象：32例 大脑前额叶皮层组织
疾病：神经退行性疾病（阿尔茨海默氏病AD，路易小体痴呆DLB，帕金森疾病痴呆PDD）
期刊：BRAIN
影响因子：10.840
研究结果
研究人员选取32例患者的大脑前额叶皮层组织，其中9例阿尔茨海默氏病（AD），7例路易小体痴呆(DLB)，8例帕金森疾病痴呆(PDD)和8例无痴呆疾病(C)作为对照，基于质谱的蛋白组学研究方法共鉴定出了10325个蛋白质，其中851个是突触蛋白质，并且25个突触蛋白含量发生显著变化。认知功能下降率与SNAP47，SYBU，LRFN2，SV2C和GRIA3蛋白密切相关，表明这些特定的突触蛋白在预测神经退行性疾病中可以作为早期疾病的检测目标。
图5 蛋白质组学数据分析
胃癌的发病率在我国恶性肿瘤中居首位，且世界上近乎一半的胃癌病人都在中国，是一种严重危害我国居民健康的常见癌症类型。胃癌中以后大约30%是弥漫型胃癌，其临床预后是比较差，且缺乏有效的治疗手段。军事医学科学院贺福初院士、秦钧教授，联合北京大学肿瘤医院沈琳教授等科学家从蛋白质组的角度将弥漫性胃癌分为三个与临床预后相关的亚型，提出了具有临床对应性的弥漫型胃癌的分子分型模式，并找出了一些潜在的药物或免疫治疗靶点。
研究对象：84例细胞样本
疾病：弥漫型胃癌
期刊：Nature Communication
影响因子：12.353
研究结果
研究人员使用高通量蛋白质组技术，对84对弥漫性胃癌的样本进行了深入的蛋白质组分析，共鉴定到11,340种蛋白，其中有2,538个蛋白在癌症和癌旁组织中差异性表达。经过生信分析，发现和癌旁组织相比， EMT转化、DNA复制、细胞周期调控相关蛋白在肿瘤组织样本中上调表达，而一些胃功能性蛋白和胃粘膜标志性蛋白也在肿瘤组织样本中出现下调。
随后研究者根据蛋白质表达的特点将弥漫型胃癌分成三个亚型——亚型PX1，PX2和PX3。作者发现从蛋白组的角度来看，PX1亚型的主要特点是细胞周期的失控，PX2亚型除了细胞周期失控以外还体现出较强的EMT转化过程，而PX3亚型中则有很多免疫应答蛋白出现上调。这些分型结果与临床信息作比较后发现，PX3亚型的患者对应着最差的临床预后，以及明显的抗化疗现象。
图6 弥漫型胃癌的免疫治疗靶点蛋白表达量分析
景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，提供领先的临床大样本的生物标记物筛选方案，以一站式蛋白质组学及修饰组学解决方案与高灵敏度的修饰类抗体，满足各类研究需求。
关于景杰
多种类的修饰类型
高特异性的修饰类泛抗体
高分辨率、高灵敏度质谱平台
经验丰富的蛋白质组学研究团队
多元化、一站式的蛋白质组学解决方案
参考文献：
[1] Nagihan Bostanci, et al. (2018), Targeted proteomics guided by label-free global proteome analysis in saliva reveal transition signatures from health to periodontal disease. Molecular & Cellular Proteomics.
[2] Ander Arbelaiz, et al. (2017) Serum extracellular vesicles contain protein biomarkers for primary sclerosing cholangitis and cholangiocarcinoma. Hepatology.
[3] Du J, et al. (2018), Murine chronic graft-versus-host disease proteome profiling discovers CCL15 as a novel biomarker in patients. Blood,.
[4] Basken J, et al. (2017) Specificity of phosphorylation responses to MAP kinase pathway inhibitors in melanoma cells. Molecular & Cellular Proteomics.
[5] Erika Bereczk, et al.,2018, Synaptic markers of cognitive decline in
neurodegenerative diseases: a proteomic approach. BRAIN.
[6] Sai, Ge, et al. A proteomic landscape of diffuse-type gastric cancer[J].Nature Communication, 2018.
更多阅读推荐
精准医学与蛋白组学
海量文献解读
行业前沿报导
长按二维码关注我们