NAT COMMUN：宏蛋白质组学揭开小儿炎症性肠病的新机制
景杰学术/报道
今天为大家解读的这篇文章来自国际专业学术期刊Nature Communications，加拿大渥太华大学的Daniel Figeys 教授团队，运用宏蛋白质组技术，结合肠道微生物与外泌体研究，对儿童初发IBD进行了大规模的肠道微生物宏蛋白质组学研究，深入揭示了IBD发生发展与宿主-微生物群互作机制之间的关联信息。
Daniel Figeys 教授团队一直致力于蛋白质组学、蛋白质相互作用的研究工作，相关研究在心血管疾病、炎症性肠道疾病和神经退行性疾病有很强的应用价值。本文中作者利用高分辨率质谱和MetaPro-IQ生物信息学工作流程，研究了新发IBD患儿黏膜与肠腔交界处（MLI）中存在的微生物群、人源和分离的细胞外囊泡(EVs)的蛋白组。
研究对微生物组的功能活性进行了表征，并确定了IBD中与对照组相比上调且未见报道的微生物功能和代谢途径。更重要的是，他们首次证实了宿主防御蛋白，包括那些产生活性氧化剂的蛋白，存在于肠道EVs中，并与小儿IBD中微生物群的功能改变相关。
炎症性肠病(IBD)是一种以肠道黏膜内壁炎症为特征的疾病，临床表现腹泻、腹痛，甚至可有血便。克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是IBD的两种主要亚型。两种亚型临床表现相似，治疗策略也相似，但疾病本身发病原因存在差异。
据统计，发达国家中将近有0.3%的人口患有IBD，发展中国家的发病率也在呈现上升趋势，特别需要留意的是全世界儿科IBD的发病率正在逐年上升。并且儿童期IBD与成人期IBD，在进展、疾病解剖位置和治疗结果方面存在差异。
儿童期发作的IBD常常会导致生长发育失败，并伴随有严重的长期持续的健康后果，从而导致较高的医疗成本。既往报道有过对成人IBD患者的有限的代谢组学研究，但缺乏针对儿童IBD患者的系统生物学研究。因此，充分了解儿童期起病IBD的发病机制，以便进行精准的治疗和长期的疾病管理，能极大帮助儿童IBD患者。
目前大多数关于IBD患者肠道微生物群特征的研究使用粪便为取样对象，然而已有的研究结果发现，儿童乳糜泻患者黏膜相关的微生物失调若仅在粪便样本中研究很难得到印证。
基于质谱的蛋白质组分析可以同时测量人体和微生物群起源蛋白，能够前瞻性的帮助破译复杂肠道生态系统中的宿主-微生物相互作用。作者首先运用了大规模的宏蛋白组学分析了小儿IBD人群的肠道微生物和其相关的人源蛋白，从而提供对IBD发生发展过程中宿主-微生物群互作机制的有价值的蛋白水平层面的信息。
接着，对早期IBD的MLI样本微生物的功能活性评估明确了新的宿主-微生物相互作用特征，包括微生物mobilome和微生物代谢（特别是L-半胱氨酸代谢）的改变。
最后，研究还发现IBD病人肠道黏膜会分泌含有宿主防御蛋白（MPO、BPI活性氧化剂）的细胞外囊泡，这些EVs一旦被微生物摄取后会引起微生物防御应激的反应和功能适应，从而导致肠道微生物群失调和后续的黏膜炎症的发展。
1. 利用宏蛋白质组学探寻MLI样本中人源和微生物的蛋白
本研究共纳入71例初治儿童患者，其中对照组24例，克罗恩病(CD)25例，溃疡性结肠炎(UC)22例。并对取自于不同部位(降结肠(DeC) 、升结肠(AsC)和回肠末端(TI))共计176 个黏膜与肠腔交界处（MLI）样本（样本策略）进行基于质谱的宏蛋白质组学方法分析，共发现了229,996个肽段和53,207种蛋白质。
图1 宏蛋白质组学探寻MLI样本中人源和微生物的蛋白
宏蛋白质组学的一个优点是微生物区系和宿主蛋白都可以在一次分析中测定。研究发现，来自人源和微生物群的53207种蛋白中，人源蛋白只有3488种，含量却占总蛋白密度的52%，说明人源蛋白虽种类较少但数量多。患有肠炎病人的样本中，人源蛋白所占比重是明显升高的。值得一提的是，在CD病人中，人源蛋白所占比重与临床疾病严重程度成正相关。
此外，小儿IBD患者肠道MLI样品蛋白质组学谱发生了变化。主成分分析(PCA)结果表明，IBD患者不同肠部位样品中，人源蛋白质组学谱存在明显差异，两种亚型CD 和UC间人源蛋白种类无法有效区分。微生物来源的蛋白在IBD患者样本与对照组有明显差异，而且与肠道部位和炎症有无并无直接关联。
图2 小儿IBD患者肠道MLI样品蛋白质组学谱发生改变
2.早期IBD的宿主-微生物相互作用特征
接下来研究者对IBD早期MLI菌群的功能活性进行了表征，并在MLI上发现了儿童IBD新的宿主菌群特征，包括微生物种类的变化和L-半胱氨酸代谢的改变，这两种变化均提示氧化应激升高。
IBD患者肠道中的硫酸盐还原菌数量和H2S的产生水平都是增加的，但是IBD儿童病人中调控H2S的产生的通路并不明确。L-半胱氨酸是生成H2S的底物，L-半胱氨酸脱硫酶可以催化L-半胱氨酸生成H2S和氨，而其蛋白水平在IBD病人的DeC和AsC部位也有明显上调。KEGG注释分析发现了60条KOs，与912种属于硫代谢和半胱氨酸/蛋氨酸代谢通路相关的蛋白。统计学数据明确了在IBD患者中，有41种蛋白差异表达，18种蛋白下调和23种蛋白上调。而相应的上调和下调的蛋白KOs在参与L-半胱氨酸代谢过程中发挥的作用。因为L-半胱氨酸和硫化氢H2S在调控黏膜炎症过程中起重要作用，所以这提示可能是微生物的代谢通路改变影响了肠道生理状况和疾病进展。
图3 IBD患者的微生物硫和半胱氨酸代谢发生改变
3. IBD导致宿主防御蛋白水平上调
研究人员随后首次对新发IBD患儿肠道黏膜分泌的EVs进行了蛋白组学表征，发现2744种蛋白（1519种来自人，1225种来自微生物），微生物蛋白丰度占总蛋白12.6%，而且相比对照组，IBD组EVs中的微生物蛋白丰度更低。
研究发现，IBD病人肠道黏膜会分泌含有宿主防御蛋白（MPO、BPI活性氧化剂）的细胞外囊泡，这些EVs一旦被微生物摄取后会引起微生物防御应激的反应和功能适应，从而导致肠道微生物群失调和后续的黏膜炎症的发展。
图4 IBD病人MLI样本中的宿主防御蛋白的水平上调
综上所述，作者首次对儿童初发IBD进行了大规模的肠道宏蛋白质组学研究，以评估肠道微生物组及其相关的人类蛋白。他们对IBD早期MLI菌群的功能活性进行了表征，并在MLI上发现了儿童IBD新的宿主菌群特征，包括微生物组和L-半胱氨酸代谢的改变，这两种变化均提示氧化应激升高。
此外，他们对新发IBD患儿肠道EVs首次进行了蛋白组学表征，证明分离EVs样品中存在的宿主防御蛋白，特别是产生活性氧的酶，这都可能导致肠道氧化应激增加。后者更可能导致微生物的防御反应和功能适应，从而启动肠道微生物的失调进而促进粘膜炎症的发展。因此，本研究提供了有价值的蛋白质水平的信息，以帮助理解宿主-微生物组相互作用的基础上的IBD的发展。
参考文献：
Zhang Xu., et al. (2018). Metaproteomics reveals associations between microbiome and intestinal extracellular vesicle proteins in pediatric inflammatory bowel disease. Nature Communications.
Khor, B., et al. (2012). Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature.
Norman, J. M. et al. (2015). Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell.
Mottawea, W. et al. (2016). Altered intestinal microbiota-host mitochondria crosstalk in new onset Crohn’s disease. Nature Communications.
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