一次性技术推动病毒疫苗生产

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使用一次性平台实施生产规模的腺病毒纯化

作者

Amélie Boulais、Nick Hutchinson 和 Fritjof Linz

生物制药行业多采用制造平台来降低工艺开发成本和新药的上市周期。利用平台工艺，仅需微调操作参数，便能够生产同一系列的多种类似产品。这样，公司便可以在新产品开发上避免重复劳动，同时也能够有效利用前期项目中的经验和教训。

生物制药公司可以完全使用一次性的产品，不必安装不锈钢设备来实施重组病毒载体平台。一次性技术工艺的安装和认证比重复使用设备更简单、更快速，成本也更低。它支持封闭式系统处理，当病毒疫苗太大而无法通过过滤灭菌时，这点便显得至关重要。

一次性技术可以降低产品交叉污染和批次间污染的风险，从而改善疫苗的安全性。膜层析已被证明是一种有效的一次性病毒纯化技术。膜的大孔结构可以使病毒简单而快速地进入内孔表面，因此它们的处理能力强，而且效果极佳。由于缺少空间排阻效应，病毒可接触所有的配体。膜层析的设计正在不断改进。

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新型膜化学

本教程介绍了如图1所示的基于单次使用平台的腺病毒生产。

▲图1.用于病毒疫苗生产的一次性平台工艺

Sartorius Stedim Biotech（SSB）结合了从实验室到生产规模的现有技术平台，以满足疫苗行业的质量要求。此方法经证明可用于20L标度的腺病毒血清型5载体的纯化。该平台完全可以在一天内纯化出疫苗。表1所示为平台最真实的性能状态，只经过了最低程度的优化。

该工艺的第一道流程始于生物反应器，无血清培养基中生长的HEK293细胞在其中进行感染。感染细胞浓度为1×106细胞/mL，5次多重感染。在细胞培养结束时执行细胞裂解步骤，最大化生物反应器的病毒颗粒的产量，但同时也会释放出大量的DNA。

在生物反应器中加入内切核酸酶（如DENARASE）消化释放的DNA，并促进随后的纯化操作。

▲表.使用20 L规模的单次使用病毒载体平台实现的工艺性能指标

DNA消化后的下一步是是从生物反应器中进行收获。病毒颗粒和深层过滤器中的硅藻土之间的静电作用可能降低该步骤的收率，因此，若可能，我们建议生产使用聚丙烯深层过滤器，如Sartopure PP3预过滤器。这是一款滤膜是由有精细的聚丙烯纤维缠绕而成的滤器，具有较好的澄清效果，提供多种型号的囊式滤器。

澄清之后应采用一个合适的除菌过滤，如Sartopore2 XLG。根据生物反应器中细胞碎片的浓度和添加的内切核酸酶的量，澄清及除菌过滤的滤器大小不定，需要在该阶段进行可滤性实验。

SSB建议在下游平台工艺中使用膜包进行超滤步骤。可以在保证此步具有很好的放大性跟收率（表）。

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超滤步骤

在超滤步骤中，我们建议生产者使用理论截留分子量为300 kDa的膜。我们在实验中，将腺病毒浓缩10倍，然后用5倍等体积的50 mM Hepes、150 mM NaCl、pH 7.5的缓冲液进行洗滤，然后进行膜层析纯化。

300k Da的PESU膜可以截留病毒颗粒，能够去除大量杂质，如DNA和宿主细胞蛋白质。

▲图2.使用Sartobind Q膜层析进行初步纯化的腺病毒血清型5的典型洗脱色谱图

（平衡：50mM Hepes，200mM NaCl，pH7.5；清洗：50mM Hepes，200mM NaCl，pH7.5；等度洗脱：65％（v/v）50mM Hepes pH 7.5，1M NaCl。洗提：50mM Hepes，pH7.5,1M NaCl）

图2显示了来自Sartobind Q膜层析步骤中的色谱图，该步骤使用结合和洗脱方式进行腺病毒纯化。由于层析硬件的限制，流速限定为1 MV/min。

然而，该步骤仅在30分钟内完成了。在这些条件下，可以实现6×1012个病毒颗粒/ mL膜的结合能力，并使DNA水平降低15倍以上。

Sartobind Q洗脱液有的需要精纯步骤来去除残留的核酸。该步骤可以使用Sartobind STIC膜层析进行，采用流穿模式进行。这款膜具有独特伯胺基的弱阴离子交换层析。

进行去除核酸操作的溶液必须还有磷酸盐，工艺开发人员应进行优化研究，以确定最佳磷酸盐浓度，使膜层析能够去除核酸，但又不结合病毒导致降低产率。

根据我们对腺病毒的经验，上样缓缓冲液含有磷酸钠浓度为250 mM时效果很好，载量可以达到6.4×1013个病毒颗粒/mL膜。该步骤使产品中DNA浓度降低至0.7 ng DNA /剂量，远低于我们的目标值，即10 ng DNA /剂量。

如果需要，可以将Sartobind STIC洗脱液浓缩，并在最终超滤步骤中使用配制缓冲液进行洗滤。对于此操作，SSB推荐使用理论截留分子量为100 kDa的膜。

稳定化再生纤维素膜包的亲水性极强，同时能够使膜通量性能和目标产物收率最大化。在腺病毒纯化期间使用Hydrosart膜包。

总之，一次性平台可用于病毒疫苗的纯化，SSB已证实其在20 L规模腺病毒制备过程中的应用。该平台具有良好的灵活性，且可以以一次性的形式放大至2,000 L。该平台是预配置的操作单元，SSB可以为其推荐合适的操作条件。

该平台几乎不需要额外的开发工作或成本，但能够使药物开发者快速确立生产工艺，并缩短新的病毒疫苗产品进入市场所需的时间。

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作者介绍：

Amélie Boulais，Sartorius Stedim Biotech集成解决方案的工艺开发顾问

([e-mail])

Nick Hutchinson博士，技术内容经理

Fritjof Linz博士，纯化技术副总裁