第五期 CRISPR/Cas9基因编辑技术学习班（上海 2018年1月19-21日）

CRISPR/Cas9技术培训背景介绍：

CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期选择压力中形成的一种适应性免疫防御，可用来有效抵御病毒及外源DNA的入侵。CRISPR的Type II已经被广泛用于基因工程，它包含Cas9，crRNA和tracrRNA，其中crRNA含有能够识别20bp的靶向互补序列。Cas9，crRNA和tracrRNA组成复合体，识别并结合crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终导致DNA的双链断裂（DSB），进而实现基因的敲除和插入。

目前，CRISPR/Cas9系统已经广泛用于对哺乳动物细胞，细菌，斑马鱼，小鼠，猪，猴的基因编辑。本学习班将详细讲解CRISPR/Cas9基因编辑工具原理，操作流程，理论结合实践，将让大家详细了解到具体如何利用CRISPR/Cas9技术构建基因修饰动物等。学习班将为相关科研工作人员和兴趣爱好者提供了很好的培训资源。 

讲师介绍：这次学习班我们邀请了两位在基因编辑领域具有丰富实操经验的教授作为主讲人，通过三天的系统学习，能让您熟悉并掌握基因编辑技术的核心知识点与详细操作技巧。

第一天主讲人：王永明教授

研究员，博士生导师，2015年国家青年千人获得者。1997-2001年就读兰州大学生命科学学院并获得学士学位，2001-2004年就读东北师范大学生命科学学院并获得硕士学位，2005-2010年在德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心（MDC）做博士生研究，并获得柏林自由大学博士学位。2010-2013年在斯坦福大学医学院从事博士后研究。2013年至今历任复旦大学生命科学学院青年研究员、研究员。 

王永明博士于2010年在斯坦福大学医学院做博士后研究，较早的开展了对基因编辑技术的研究和应用，主要贡献有1）首次把基因编辑技术用到了心血管领域，论文发表在Circulation Research上，被评为2012年度心脏领域最好的论文；2）首次用基因编辑技术制作了长QT综合症干细胞模型；3）发明了附着体CRISPR/Cas9技术，可以高效的敲除基因；4）发明了高通量测试gRNA效率的方法，筛选了5万多个gRNA的活性。

第二天与第三天主讲人：李博士

德国慕尼黑工业大学海归博士，具有多年丰富的基因编辑实操经验

参与德意志研究基金委项目(DFG)用于人类癌症研究的转基因克隆猪模型 (SCHN971/3-1)

Ø博士导师为原英国Roslin Institute克隆羊“多莉”团队的Prof. Dr. Angelika Schnieke

Ø成功构建世界上第一头ROSA26双荧光猪模型，极具有生物医学价值(已发表)。随后，成功构建Kras点突变基因修饰克隆猪模型，该模型为构建胰腺癌大动物模型提供了有力工具，为胰腺癌相关靶向药物开发，寻找新的胰腺癌治疗手段等提供了新的动物模型。

日程安排

第一天周五上午 9：00-12：00

1. 基因编辑技术原理

2. 基因编辑技术应用

3. 三种基因编辑技术（ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9）介绍

4. 其他类型的CRISPR核酸酶介绍（Cpf1, SaCas9,人工改造后的Cas9）

5. CRISPR/Cas9常用载体介绍

6. 基因序列分析（请自带可无线上网之笔记本电脑或手机，在线设计演练）

7. 设计gRNA的网站（在线设计演练）

8. 构建gRNA表达载体（设计演练）

9. PCR引物设计（设计演练）

                   第一天周五下午 13：00-18：00

10. 基因敲除的方法（设计演练）

11. 基因敲入的方法（设计演练）

12. 检测脱靶的方法

13. 提高CRISPR/Cas9特异性的方法

14. CRISPR/Cas9导入细胞的方法

  第二天 周六 上午 9:00-12:00

内容

1, px330质粒系统介绍。

2，sgRNA oligos模板退火方案。

3，退火gRNA与线性化CRISPR/Cas9载体连接详细方案。

4，连接产物转化到大肠杆菌（DH5α）。

5，转化产物涂板培养。

6，鉴定插入oligo后的基因编辑质粒ps330质粒体系。

7，构建同时敲除两个基因的质粒体系。

8，如何构建CRISPR/Cpf1质粒体系。

9，CRISPR/Cpf1质粒体系鉴定。

第二天周六下午 13:00-18:00

1，Cas9的多功能系统（如Cut, Nick, Activate, dCas9-FokI）的详细介绍。

2，利用CRISPR/Cas9构建基因修饰小鼠方法介绍和实际操作方案

3，CRISPR/Cas9相关基因修饰小鼠模型介绍和操作方案

4，利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大动物（猪、猴）方法介绍和实际操作方案

5，CRISPR/Cas9与基因修饰大动物模型介绍和详细操作方案

专题：利用CRISPR/Cas9技术编辑动物细胞系

1， CRISPR/Cas9质粒细胞转染方法

2， 阳性细胞克隆筛选

3， 基因编辑细胞系的建立

4， 基因修饰情况分析方法

第三天 周日  上午9:00-12:00

1， CRISPR/Cas9重组子细菌克隆挑取，扩大化培养，鉴定，

2， 基因修饰基因组DNA模板（转染CRISPR/Cas9到动物细胞后提取DNA）制备

3， 目的靶基因的基因组DNA片段的PCR扩增，电泳检测PCR产物

4， PCR产物退火变性，T7E1酶切，电泳鉴定基因修饰情况

专题：利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除或敲入小鼠

1，基因编辑工具CRISPR/Cas9基本背景介绍

2，sgRNA设计及其功能验证

3，小鼠受精卵分离和培养

4，CRISPR/Cas9系统显微注射到小鼠受精卵

5，受精卵显微注射后回输到代孕母鼠体内

6，PCR和T7E1分析和鉴定基因敲除小鼠（Founder）

7，基因敲除小鼠基因敲除情况分析

8，CRISPR/Cas9构建基因敲除小鼠详细实验流程归纳和总结

第三天 周日 下午13:00-15:00

专题：实验结果的点评与讨论

1， CRISPR/Cas9载体构建讨论

2， 目的靶基因的基因组DNA片段的PCR扩增，电泳检测PCR产物结果讨论

3， PCR产物T7E1酶切，电泳鉴定基因修饰情况结果讨论

4， Sanger测序鉴定基因编辑结果

1） CRISPR/Cas9质粒阳性转化子测序结果确认

2） Sanger测序阅读基因编辑情况

3） 如何从测序色谱图中阅读靶向突变等位基因型

专题：利用CRISPR/Cas9技术构建基因修饰大型动物（猪）

1， 利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大型动物（猪）流程

2， 基因修饰大型动物优势

3， 利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大动物（猪）模型介绍

专题：CRISPR/Cas9脱靶问题分析

1， 脱靶产生的原因

2， 脱靶检测方法

3， 降低脱靶问题的方法

专题：基因编辑工具拓展

1， CRISPR/Cas9技术的发展与应用

2， 新基因编辑工具Cpf1，C2C2的用法与比较

3， 基因编辑工具的伦理问题

4， 基因编辑工具的应用拓展。

5， 根据学员的研究内容，详细答疑如何使用基因编辑工具。

第五期上海CRISPR/Cas9基因编辑学习班时间，地点培训时间：2018年1月19 日-1月21日培训地点： 上海好望角大饭店（肇嘉浜路500号）相关介绍

注意点：每人需要带笔记本电脑！ 

【收费标准】

注册费：3300元每位（注册费包含电子版教材、午餐，欢迎晚宴费用，住宿费自理。）

优惠政策：

1. 1月10号之前确认报名及转账的优惠 100 元

2. 三人组团报名，每人可优惠100元

3.  四人组团报名，每人收费3000元，

4.  五人组团报名缴费，额外带一人免费注册！ 

可以开正规会务发票，纸质邀请函（盖红章）。 

 推荐下面三个基因编辑用的质粒可以选择订购，每个质粒500元 （发票单独开）  

      1，ps330A-cas9-sgRNA（可插入任意20bp靶点序列）
      2，ps330S-2-cas9-sgRNA（可用于同时敲除2个靶点的载体）
      3，p-p53-cas9-GFP （可用于小鼠p53基因敲除的载体）

报名方式：

扫描下面二维码识别，即可报名登记！

咨询电话：[phone]

金老师：18917745941

王老师：13818765978

医药加平台创始人金永红与复旦大学青千王永明教授合影！

往期上海基因编辑学习班合影

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