伤口愈合是一个动态的过程，它涉及一系列分子和细胞事件，旨在替换失活和缺失的细胞成分和/或组织层。近年来，细胞外小泡(EVS)因其促进伤口愈合和组织再生的能力而受到广泛关注。EVS是细胞分泌的脂膜结合的囊泡，含有蛋白质、脂类和核酸等生物物质。然而，目前EVS作为治疗药物的开发受到分离产率低和分离过程繁琐的限制。为了克服这些挑战，通过将间充质干细胞(MSCs)通过不同孔径的膜来剪切，获得了模拟EV的生物灵感细胞衍生纳米颗粒(CDN)。物理特征和高通量蛋白质组学证实，MSC-CDN模拟MSC-EVS。此外，这些MSC-CDN可被人皮肤成纤维细胞有效摄取，并呈剂量依赖性地激活MAPK信号通路，促进细胞增殖、细胞迁移、生长因子和细胞外基质蛋白的分泌，从而促进组织再生。值得注意的是，在3D聚乙二醇化纤维蛋白支架和动物模型中，MSC-CDN促进了人真皮微血管内皮细胞的血管生成，促进了体外和体内伤口的愈合。这些发现表明，MSC-CDN在促进创面愈合和组织再生方面可以替代全细胞和EVS。题目：Cell-derived nanovesicles from mesenchymal stem cells as extracellular vesicle-mimetics in wound healing译名：间充质干细胞来源的纳米囊泡作为创伤愈合中的细胞外囊泡模拟物期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B DOI号：https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.10.022创伤愈合是一种复杂的、动态的损伤反应，它涉及多种成分的相互作用，如细胞(血小板、巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞)以及细胞因子网络、趋化因子、细胞外基质(ECM)蛋白、生长因子(蛋白质和microRNAs)、血管和神经。创面修复的级联过程需要分子和细胞事件，包括细胞增殖和迁移、血管生成、细胞外基质沉积和组织重塑。不幸的是，慢性无法愈合的创面与细胞增殖和迁移减少、血管生成减少、炎症反应减弱以及生长因子和趋化因子的产生减少有关。这个复杂的过程需要几个月到几年的时间才能完全恢复伤口，对于有潜在慢性病(如糖尿病皮肤溃疡或大面积烧伤)的患者来说，这一过程往往会延迟。总体而言，该结果证实了MSC-CDN的生产过程是健壮的和可重复性的，因为它保留了EV的物理和生物学特征。此外，我们首次报道了这些msc-cdns作为ev的模拟物，在体外和体内以与evs和作为对照的整个msc细胞相似的速度促进伤口愈合，从而为有前景的、可扩展的再生方法铺平了道路。从MSC细胞生产MSC-CDN的过程如图1a所示，并改编自我们之前报道的方案：将MSC细胞加入装有不同孔径(10 mm和8 mm)过滤器的旋转杯中，并利用离心力进行剪切。选择这些孔径(10 mm和8 mm)的膜过滤器是基于一种优化的方案，该方案能够生产具有理想的尺寸、多分散性和蛋白质含量的纳米微囊(CDN)。在14,000g的离心力下，可形成脂双层片段，这些片段自发地自组装成纳米球形脂双层结构，称为CDN。在这个自组装过程中，来自MSCs的各种生物货物(蛋白质、脂类和核酸)被整合到CDN中。这样形成的CDN通过尺寸排除层析进一步纯化，以获得所需的尺寸范围，以便通过0.22 mm的膜过滤器进行灭菌。NT A测得MSCCDN的流体力学直径为136±12.44 nm蛋白质是EVS最重要的生物成分之一，参与细胞间通讯等重要过程。在EV的生物发生过程中，各种细胞膜蛋白、跨膜蛋白和胞浆蛋白作为天然的生物货物被分选到EV中。此外，EV的关键表面蛋白(细胞膜蛋白)已被证明与其在各种疾病中的内在靶向作用有关。因此，进行蛋白质组学分析以评估MSC-CDN在蛋白质方面与EVS的相似性，然后将蛋白质组学图谱与ExoCarta数据库中列出的顶级蛋白质进行比较。在本研究中，在95%可信区间(CI)和1%FDR分析下，在每个独立的生物重复中，MSC-CDN中鉴定出w1400个蛋白质，在MSC-EVS中鉴定出656个蛋白质。此外，在这三个独立的生物复制中，1092(78%)蛋白质是共同的，这表明我们的CDN通过旋转杯(我们证明通过挤压也可以放大，数据没有显示)的生产方案是可重复性的，并且在产生具有一致蛋白质谱的MSC-CDN方面是健壮的。此外，在MSC-CDN和MSC-EV样本中，有72.5%的蛋白质(在MSC-EVS的656个蛋白质中有476个)是相同的，这表明MSC-EVS中的大多数天然蛋白质在我们的模拟中被保存了下来。创面愈合的增殖期包括成纤维细胞的增殖和向创面的迁移，被认为是创面愈合的重要阶段之一。HDF细胞增殖并向伤口床迁移，以恢复损伤后皮肤的完整性。为探讨MSC-CDN能否诱导HDF细胞增殖，用不同浓度(5和50 mg/mL)的MSCCDN处理HDF细胞，并与未处理的细胞(对照组)进行比较。有趣的是，经MSC-CDNS处理的HDF细胞以剂量和时间依赖的方式促进细胞增殖。结果表明，经5 mg/mLMSC-CDN和50 mg/mLMSC-CDN作用24 h后，细胞增殖率显著高于未处理细胞。此外，经50 mg/mLMSC-CDNS处理72小时后，HDF细胞的增殖率是未处理细胞的3倍以上。通过增殖细胞核抗原(增殖细胞核抗原)和Ki-67的免疫印迹分析进一步证实了细胞的增殖。通过细胞剪切法成功地从MSCs中获得了拟EV的CDN。MSC-CDN在大小和Zeta电位方面模仿了自然细胞分泌的电动汽车，同时需要一种更简单和方便的生产方法。MSC-CDN针对与多种生物学功能(细胞黏附、细胞增殖)相关的关键规范蛋白模拟EVS，这些功能负责伤口愈合。这些MSC-CDN激活了HDF细胞中的MAPK信号通路，促进了HDF细胞的增殖和向伤口床迁移，同时促进了HDF细胞释放与细胞增殖相关的标志物、生长因子和ECM蛋白。我们首次证明，作为EV模拟物的MSC-CDN促进了体外培养的HDME细胞和HDF细胞在三维聚乙二醇纤维蛋白支架中的血管生成。在体内创伤(切除)小鼠模型中，MSC-CDNS也促进了伤口的愈合，其程度与MSC-EVS甚至MSCs(全细胞)相似，几乎是未经处理的对照组小鼠的2倍。除了在伤口愈合方面类似的治疗效果外，MSC-CDNS似乎还提供了几个优于EVS和MSCs的优势：在生产时间、产量和成本方面，CDNS生产细胞不需要分泌小泡(这是一个繁琐的过程，仅导致几毫克EVS的蛋白质含量)和/或使用不含EV的培养液(与正常细胞生长介质相比，这非常昂贵)；它们可以由融合细胞直接生产(可以在生物反应器中连续培养)，并且能够通过挤压进行放大生产。此外，CDN可以很容易地冷冻干燥并在室温下以粉末形式储存6个月以上，而不会影响其物理、形态和固有的生物学特性。MSC-CDNS的冷冻干燥将避免冷链，并使样品处理更简单。此外，与MSCS相比，MSCCDN应用程序涉及的道德要求最低。总体而言，这项研究强调了CDN在各种生物医学应用中的前景，尽管未来需要进一步研究它们的急性和慢性毒性以及最终的免疫原性。https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.10.022
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