Parthenolideameliorates colon inflammation through regulating Treg/Th17 balance in a gut microbiota-dependentmanner
译名：小白菊内酯通过肠道菌群调节Treg/Th17平衡改善结肠炎症
期刊：Theranostics
IF：8.063
发表时间：2020.04
通讯作者：赵晓晏、杨仕明
通讯作者单位：重庆第三军医大学新桥医院消化内科
炎症性肠病（IBD）是全球性的健康问题，肠道微生物群失调在其中起着重要的致病作用。然而，目前用于IBD治疗的药物远非最佳。先前的研究表明，小白菊内酯（PTL）不仅具有抗癌特性，而且具有很强的抗炎活性。
理由：研究PTL对结肠炎症的保护作用，并证明其潜在的肠道菌群依赖性机制。
方法：通过体重变化，死亡率，结肠长度，疾病活动指数（DAI）评分，H＆E染色和结肠镜检查评估来测量小鼠模型中结肠炎症的严重程度。通过16S rRNA测序和靶向代谢组学分析肠道菌群改变和短链脂肪酸（SCFA）的产生。进行Luminex细胞因子微阵列和酶联免疫吸附测定（ELISA），以测量结肠细胞因子谱。通过流式细胞仪对固有层和脾中免疫细胞的频率进行表型分析。
结果：经PTL处理的小鼠显示出明显的结肠炎症缓解，体重减轻，存活率降低，结肠长度缩短，DAI评分，组织学评分和结肠镜检查评分降低证明了这一点。值得注意的是，当使用抗生素混合物耗尽肠道菌群时，PTL对结肠炎症的保护作用消失了。 PTL治疗下调结肠组织中促炎细胞因子（包括IL-1β，TNF-α，IL-6和IL-17A）的水平，并上调免疫抑制性细胞因子IL-10。 16S rRNA测序表明，经PTL处理的小鼠表现出更为丰富的肠道微生物多样性和菌群组成。靶向代谢组学分析表明，经PTL处理的小鼠的SCFA产量增加。此外，PTL给药选择性地上调了结肠调节性T（Treg）细胞的频率，并下调了结肠T辅助型17（Th17）细胞的比例，从而改善了Treg / Th17平衡以维持肠道稳态。进行肠道菌群消耗和粪便菌群移植（FMT）以证实这种肠道菌群依赖性机制。
结论：PTL以肠道菌群依赖性方式改善了结肠炎症。潜在的保护机制与通过增加的微生物来源的SCFA产生介导的肠粘膜中Treg / Th17平衡的改善有关。总的来说，我们的结果证明了PTL作为预防和治疗IBD的潜在肠道菌群调节剂的作用。
1. 小白菊内酯PTL治疗改善了DSS诱导的结肠炎
图1 PTL治疗改善了DSS诱导的实验性结肠炎。(A)为了评估实验性结肠炎和修复，两组年龄在8-10周的WT小鼠给予3.0% DSS口服7天，然后继续正常饮水7天。腹腔注射DSS组和PTL+DSS组100μl盐水或100μl PTL解决方案从0到14天,分别。(B)体重变化。(C)的生存。(D)疾病活动度指数(DAI)评分。(E)结肠外观和结肠长度的代表性图片。(F)具有代表性的显微照片(放大40倍和200倍)和组织学评分。(G)具有代表性的结肠镜检查图像及结肠镜检查评分。(A-G)每组n = 10只小鼠，平均值±SD，p值采用非配对t检验* p< 0.05，** p<0.01，***p< 0.001。数据来自三个独立的实验，每组10只老鼠
2. PTL以肠道微生物依赖的方式减轻结肠炎
图2 肠道菌群耗尽后PTL对DSS诱导结肠炎的保护作用消失。(A) WT小鼠在DSS治疗前，进行为期5天灌胃抗生素的肠道菌群耗竭疗程。ABX (DSS)和ABX (PTL+DSS)组分别为100μl腹腔内注射生理盐水或100μl PTL从0到14天。(B)体重变化。(C)生存。(D)DAI得分。(E)结肠外观和结肠长度的代表性图片。(F) H&E染色的代表性显微照片(放大40倍和200倍)和组织学评分。(G)具有代表性的结肠镜检查图像及结肠镜检查评分。(A-G)每组n = 10只小鼠，平均值±SD，p值采用非配对t检验* p< 0.05，** p<0.01，***p< 0.001。数据来自三个独立的实验，每组10只老鼠。
3. 粪便微生物移植减轻结肠炎
图3 粪便微生物移植减轻DSS诱导的实验性结肠炎。(A) WT小鼠在FMT前进行为期5天的肠道微生物群耗竭口服抗生素疗程。小鼠灌胃FMT后5天，肠道休息3天，正常饮水后7天，给予3.0% DSS处理。(B)体重变化。(C)生存。(D)DAI得分。(E)结肠外观和结肠长度的代表性图片。(F) H&E染色的代表性显微照片(放大40倍和200倍)和组织学评分。(G)具有代表性的结肠镜检查图像及结肠镜检查评分。(A-G)每组n = 10只小鼠，平均值±SD，p值采用非配对t检验* p< 0.05，** p<0.01，***p< 0.001。数据来自三个独立的实验，每组10只老鼠。
4. PTL处理显著改变了肠道菌群的多样性和组成
图4 PTL处理显著改变了肠道菌群的多样性和组成。(A) Alpha多样性箱线图(观察物种，Chao, Shannon和Simpson相互作用)。(B)利用Bray-Curtis度量距离进行主坐标分析(PCoA)计算beta多样性。(C) PCoA使用非加权unifrad计算beta多样性。(D) PCoA使用加权unifrad计算beta多样性。(E) LEfSe的分类学图，描述了DSS和PTL+DSS组的微生物群落之间的分类学关联。每个节点代表一个特定的分类类型。黄色节点表示DSS组和PTL+DSS组分类学特征不显著。橙色节点表示PTL+DSS组的分类类型比DSS组丰富，蓝色节点表示DSS组的分类类型比PTL+DSS组丰富。(F)通过DSS组和PTL+DSS组差异丰富的特征计算LDA评分。特征选择的标准是log LDA score > 3.6。(G)在属水平上选择的差异最丰富特征热图。蓝色代表较少的丰度，白色代表中间的丰度，红色代表最丰富的丰度。
5. PTL处理增加代谢物SCFAs
图5 PTL处理提高了微生物代谢产物SCFA的产量。(A) PTL+DSS组和DSS组盲肠内容物和粪便中SCFA的浓度。组间差异采用Wilcoxon检验，显著性差异有:醋酸盐:盲肠盲肠p <0.01 &粪便p <0.01;丙酸钠: 盲肠p <0.01 &粪便p = 0.03，异丁酸:盲肠p <0.01 &粪便p <0.01，丁酸: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01;同戊酸盐:盲肠p = 0.04，粪便p= 0.05，戊酸盐:盲肠p>0.05和粪便p>0.05;总SCFA: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01。(B) FM(PTL+DSS)和FM(DSS)组盲肠内容物和粪便中SCFA的浓度。醋酸盐: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01;丙酸钠: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01，异丁酸: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01，丁酸: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01;同戊酸盐:盲肠p>0.05和粪便p>0.05，戊酸盐:盲肠p>0.05和粪便p>0.05;总SCFA: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01。(A-B)每组n = 6只小鼠，取平均值±SD, p值采用非配对t检验。
6. PTL可下调DSS诱导的结肠炎的促炎细胞因子和上调抗炎细胞因子
图6 PTL治疗改变了结肠炎小鼠的细胞因子分布。(A) 以Luminex为基础的免疫测定法测定结肠组织上清细胞因子的火山图。(B) Luminex检测结肠组织上清细胞因子水平(PTL+DSS组，n = 8；DSS组，n = 6)。利用微阵列(SAM)的显著性分析鉴定组间组织上清蛋白水平的显著性差异(q < 0.001, fold-change > 2)。图中显示了SAM阳性蛋白的分级聚类(无监督的，欧几里德距离)热图。所有蛋白的原始平均荧光强度(MFI)在聚类前进行log2转化。(C) ELISA测定PTL + DSS和DSS组结肠组织匀浆细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和IL-17A水平。(D) ELISA测定ABX (PTL + DSS)和ABX (DSS)组结肠组织匀浆细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和IL-17A水平。(E) ELISA测定FM(PTL+DSS)和FM(DSS)组结肠组织匀浆细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和IL-17A水平。(C-E)每组n = 5只小鼠，取平均值±SD。数据来自三个独立的实验，每组有5只老鼠。
7. PTL通过调节Treg/Th17平衡形成肠道免疫应答
图7 PTL处理改变了LP中Treg细胞和Th17细胞的频率。(A)采用流式细胞术和柱状图分析PTL+DSS组和DSS组结肠LP和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+ (Treg)细胞百分比。(B) PTL+DSS组和DSS组结肠LP和脾脏中IL-10+Foxp3+细胞代表性图及IL-10+Foxp3+细胞百分比柱状图。(C) PTL+DSS组和DSS组结肠LP和脾脏中CD4+IL-17A+(Th17)细胞的代表性图和Th17细胞百分比柱状图。图号表示CD4+ T细胞在各自象限的百分比。
8. PTL以肠道微生物依赖的方式调节Treg/Th17平衡
图8 肠道菌群耗竭和FMT后小鼠LP中Treg细胞和Th17细胞的频率。(A)采用流式细胞术分析ABX(PTL+DSS)组和ABX(DSS)组结肠LP中的Treg细胞，并显示Treg细胞百分比的条形图。(B) ABX(PTL+DSS)组和ABX(DSS)组结肠LP中IL-10+Foxp3+细胞的代表性图和图形分析。(C) ABX(PTL+DSS)组和ABX(DSS)组结肠LP中Th17细胞的代表性图和图形分析。(D)采用流式细胞术分析FM(PTL+DSS)组和FM(DSS)组结肠LP中的Treg细胞，并显示Treg细胞百分比的柱状图。(E) FM(PTL+DSS)组和FM(DSS)组结肠LP中IL-10+Foxp3+细胞的代表性图和图形分析。(F) FM(PTL+DSS)组和FM(DSS)组结肠LP中Th17细胞的代表性图和图形分析。图号表示CD4+ T细胞在各自象限的百分比。
综上所述，经PTL处理的小鼠显示出明显的结肠炎症缓解，体重减轻，存活率降低，结肠长度缩短，DAI评分，组织学评分和结肠镜检查评分降低证明了这一点。值得注意的是，当使用抗生素混合物耗尽肠道菌群时，PTL对结肠炎症的保护作用消失了。 PTL治疗下调结肠组织中促炎细胞因子（包括IL-1β，TNF-α，IL-6和IL-17A）的水平，并上调免疫抑制性细胞因子IL-10。 16S rRNA测序表明，经PTL处理的小鼠表现出更为丰富的肠道微生物多样性和菌群组成。靶向代谢组学分析表明，经PTL处理的小鼠的SCFA产量增加。此外，PTL给药选择性地上调了结肠调节性T（Treg）细胞的频率，并下调了结肠T辅助型17（Th17）细胞的比例，从而改善了Treg / Th17平衡以维持肠道稳态。进行肠道菌群消耗和粪便菌群移植（FMT）以证实这种肠道菌群依赖性机制。