网络药理学和机器学习方法揭示中药复方治疗冠心病“同病异治”的潜在作用机制

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1 研究背景

中医药历史悠久，在防治复杂疾病方面具有独特优势。整体观和辨证论治是中医的基本指导原则，病证结合、方证相应是中医长期实践中形成的特色诊疗模式。冠心病在中医上分成多种证型，且中医运用不同的中药复方治疗不同证型的冠心病。然而，冠心病中医辨证论治的潜在作用机制是不清楚的。因此，本研究用网络药理学和机器学习方法研究中药复方治疗冠心病“同病异治”的潜在作用机制。

2 材料与方法

2.1技术路线（图文简介）

2.2 数据准备

2.2.1 冠心病中医证型和对应中药复方

根据《冠心病心绞痛中医专家诊疗共识》，搜集了8个典型的冠心病证型及相对应推荐使用的中药复方，结果见表1。8个中药复方共计包含34味药材。

2.2.2 中药对应的现代医学症状

SymMap数据库收集了中药对应的中医症状，并通过专家审核将这些症状对

应到统一医学语言系统中的现代医学症状。通过搜索SymMap数据库，共搜集了34位药材对应的364个现代医学症状。

2.2.3 中药活性小分子搜集及靶标预测

针对34味药材，从TCMID和TCMSP数据库中共搜集3099个化合物。并根据类药性原则（表2），过滤得到669个潜在活性小分子。

利用DrugBank、STITCH、SwissTargetPrediction、targetNET等数据库和工具，共预测得到581个蛋白编码的靶点。具体小分子、靶点数量信息见表3。

2.2.4 冠心病疾病基因搜集

从DisGeNET、iCTNet及文献中共搜集345个蛋白编码的冠心病疾病基因。

2.2.5 心血管疾病小分子药物及其靶点搜集

根据ATC编码分类，从DrugBank数据库中共搜集316个FDA认证的用于治疗心血管疾病的小分子药物及其327个靶点。

2.2.6 人类蛋白-蛋白相互作用网络

共搜集并构建两个人类蛋白-蛋白相互作用网络。一是STRING，取可靠性分大于0.9，包含9941个节点和227186条连边；二是BNet，包含16677个节点和243603条连边。

2.3 基于网络的药物疗效评价

本研究利用两种网络算法来评估药物对疾病的疗效。

2.3.1 药物靶点与疾病基因之间的相关性

分别以药物靶点和疾病靶点作为种子节点在背景网络STRING中运行RWR算法，得到影响向量后计算两者之间的相关系数。再计算基于随机结果的Z-score值（式1），刻画药物靶点和疾病基因之间相关性的程度。

2.3.2 药物靶点和对照药物靶点的网络邻近度

计算药物靶点集合（A）和对照药物靶点集合（B）在背景网络（BNet）中的网络最短距离，进而得到药物靶点和对照药物靶点的网络邻近度（式2）。

2.4 聚类方法

本研究分别用网络聚类和层次聚类方法来研究冠心病八个证型对应的中药复方之间的关系。

2.4.1 网络聚类

类似于社会网络中的社区识别，网络聚类能够得到网络中内部联系紧密的模块，且模块化指标（式3）用来衡量网络模块化程度。

2.4.2 层次聚类

层次聚类是一种无监督机器学习方法，通常包括三个步骤。

①    计算目标的特征图谱

②    根据特征谱计算目标之间的相似性

③    基于相似性聚类

2.5 中药复方重要靶点识别算法

基于网络生物学中的‘连接有罪’原则，本研究设计了一个中药复方靶点重要性的识别算法。具体而言，药物作用的靶点在背景网络中与疾病基因联系越紧密，其重要性越高。结合功能相似性和拓扑相似性，靶点i与疾病关联的重要性分数定义为：

进一步，和另外4种重要性分数算法（式7~10）进行重要靶点识别性能比较，说明了整合功能相似性和拓扑相似性的优势。

2.6 中药复方潜在靶点和作用效果的文本挖掘验证

通过搜索PubChem和PubMed数据库，对识别到的中药复方的重要靶标和挖掘的中药复方对冠心病的功效进行文献挖掘验证。

3 研究结果

3.1 中药复方及治疗心血管疾病西药小分子的靶标类别分析

所有中药复方的581个靶标主要分为酶、膜受体、转录因子、离子通道等，其中酶和膜受体占比高（图1A）。治疗心血管疾病西药小分子的327个靶标主要包含酶、离子通道、G蛋白偶联受体、转运体等。两个靶点集合的交集为144个，以酶、G蛋白偶联受体、转运体为主。

3.2 中药复方对冠心病作用的网络分析

八个中药复方作用靶点与冠心病疾病基因在STRING背景网络上具有正向关性，且与随机比较具有显著意义（Z-score > 3，图2A）。

各个中药复方作用靶点与9类ATC编码分类的心血管药物作用靶点在BNet背景网上邻近度高，且所有复方作用靶点与脂质调节、心脏治疗西药小分子作用靶点连接更紧密（图2B）。

3.3 八个中药复方的多层面比较分析

运用网络聚类和层次聚类，从药材、现代医学症状、潜在活性小分子、作用靶标、富集通路等层面对八个中药复方进行比较，结果见表4和图3。

所有层面上，8个中药复方聚为5类。5个层面上聚类结果基本一致，且现代医学症状、作用靶标、富集通路三个层面上聚类结果相同，提示了这八个中药复方对冠心病辨证论治在分子层面上的内在关系。

进一步，本研究总结了八个复方共同和特异对应的现代医学症状和信号通路（表5）。八个复方共同对应的典型现代医学症状有疼痛、痛觉过敏、虚弱，共同信号通路有7条（5-羟色胺能神经突触、cAMP信号通路、钙信号通路、花生四烯酸代谢、卵巢类固醇生成、氮代谢、类固醇激素生物合成）。

3.4 识别各中药复方的重要靶标

根据“连接有罪”原则，结合功能和拓扑相似性，设置相似度得分≥0.09，共得到99个所有中药复方的重要靶点。每个复方的重要靶点及它们的交集信息见图4。八个复方有21个共同重要靶点，其中11个是冠心病疾病基因，提示这些复方对冠心病的共同治疗作用。

为评估结合功能和拓扑相似性的优势，本研究另外构建了仅考虑功能、仅考虑拓扑相似性、用最短距离衡量拓扑相似性等相关的4个指标（式7~10），并计算比较了识别重要靶标的AUC（ROC曲线下方面积）和AUPR（precision-recall曲线下方面积）。结果（图5）显示，整合功能相似和拓扑相似的指标表现最好，且用RWR网络传播算法比用最短距离衡量拓扑相似性效果更好。

此外，将识别到的重要靶点映射到八个复方对应的共同和特异通路上（图6），发现一些重要的靶点（如NOS3和RAC1），被映射到共同和特异的信号通路上。因为相同的基因可能参与不同的信号通路，所以部分基因出现在多个通路上（如NOS3、ALOX5和RAC1）。

3.5 文献挖掘验证复方的重要靶点和治疗机制

通过搜索PubChem数据库，每个复方有1.5%~5.8%的“中药小分子-靶标”关系及1.3%~9.3%的“中药小分子-重要靶标”关系被验证（图7A）。对于所有复方，共114个靶点（约占所有581个靶点的20%）有文献报道的实验证据，且被验证到的重要靶标相对比例比所有靶标高（图7B）。

另外，通过搜索PubMed数据库，八个复方中7个复方的部分治疗机制被文献验证。例如复方1（冠心二号方）在心肌梗死大鼠模型中通过上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，来刺激缺血区域的血管生成以补偿心脏供血；复方7（左归饮）通过补肾对慢性肾病大鼠有潜在治疗效果，而复方8（参附汤合右归饮）通过抑制TGF-β/Smad信号通路对肾小管间质纤维化起肾脏保护作用；复方2,5,6（血府逐瘀汤、八珍汤、生脉散加味）在相应的动物模型中具有抗炎作用等。

4 研究结论

4.1 基于两个网络指标，中药复方靶点与冠心病疾病基因显著相关，且与9类心血管疾病小分子药物的靶点存在一定程度的重叠，从分子层面说明中药复方对冠心病的有效性。

4.2 基于网络聚类和层次聚类，从药材、现代医学症状、活性化合物、靶标、富集通路等5个层面上系统比较8个典型证型对应的中药复方，发现所有复方被分成5类，且多层面的聚类结果基本相一致。所有复方共同参与了7个和冠心病密切相关的信号通路，具有缓解心绞痛的作用。同一类的复方共同调控了部分特有的通路，并对应具体的适应证。例如，用于气滞血瘀、气虚血瘀、气阴两虚的三个复方作用于TNF和NF-κB信号通路，发挥抗炎和增强免疫作用。用于心肾阴虚和心肾阳虚的两个复方调节属于内分泌系统的PPAR和thyroid hormone信号通路，可改善肾功能。

4.3 基于连接有罪原则，利用设计的一种整合功能相似和拓扑相似的靶标排序算法，识别了中药复方的99个重要靶点。八个复方共有23个重要靶点，其中11个是冠心病疾病基因。此外，结合功能相似和拓扑相似的方法比只考虑功能相似或只考虑拓扑相似的方法预测表现更好。

4.4 文本挖掘结果验证了约20%的预测靶标和中药复方不同聚类结果对应的治疗作用。

本研究从系统生物学角度阐述了中药复方对不同证型冠心病的用药模式及其科学意义，有助于从现代医学角度理解中医的辨证论治原则和中药复方治疗冠心病“同病异治”的潜在作用机制。

参考文献

Yang J, Tian S, Zhao J, Zhang W. Exploring themechanism of TCM formulae in the treatment of different types of coronary heartdisease by network pharmacology and machining learning[J]. PharmacologicalResearch, 2020: 105034.

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