【中国中药杂志】中国中医科学院：溃疡性结肠炎活动期关键基因与治疗中药的生信分析及系统评价

【写在前面】：今天给大家分享一篇发表于中国中医杂志的生信方面文章(问卷调查：选择您最希望我们公众号推送的文章类型)，为溃疡性结肠炎活动期关键基因与治疗中药的生信分析及系统评价（DOI: doi: 10. 19540 /j. cnki. cjcmm.20200115.501，也可点击原文链接获取原文）。该文由浙江中医药大学/浙江中医药研究院的柴可群团队完成。

      我们恳请：若能转发分享，我们将非常感谢！（目前微信公众号改为乱序推送，将如沐风科研维修站设为星标，时常点击阅读，我们才会出现在您推送的前面位置）。

【期刊简介】

来自CNKI

【作者信息及摘要】

摘要：GEO 数据库下载包含溃疡性结肠炎活动期基因芯片数据GSE75214，GSE48959。以调整 P＜0. 05 及 | log2 FC | ≥ 1. 5 为筛选差异基因的标准进行分析，得出溃疡性结肠炎(UC)活动期差异基因。STＲING数据库进行 PPI 分析，DAVID数据库进行 GO 及 KEGG pathway 分析。Cytoscape 软件对活动期差异基因进行可视化并计算出活动期关键基因。Coremine Medical分析治疗关键基因的中药并进行系统评价。最终筛选出符合条件的活动期 139 个差异基因(109 个上调基因，30 个下调基因) 。DAVID分析这些差异基因的生物与通路主要富集在炎症反应、免疫反应、趋化因子活性、TNF 通路、NF-κB 通路、Toll 样受体通路等方面。Cytoscape 软件计算出IL-6，CXCL8，IL-1β，MMP9，CXCL1，ICAM1，CXCL10，TIMP1，PTGS2，CXCL9 为 UC 活动期关键基因。Coremine Medical分析得出治疗UC活动期的中药有姜黄、黄芩、郁金，其中黄芩有清热祛湿、泻火解毒功效，符合UC活动期病机，且临床常用于治疗湿热泄泻，故选以黄芩为君药的方剂(黄芩汤)进行系统评价。经过评价可知黄芩在提高临床有效率、降低炎症因子及免疫球蛋白水平方面均优于单纯西医治疗，差异具有统计学意义，且不良反应少。该研究对UC活动期基因及其作用机制的分析为进一步深入研究 UC活动期发病机制提供了新思路，对治疗UC活动期中药及系统评价为临床中医药防治 UC提供了依据。

【前言】

溃疡性结肠炎( ulcerative colitis，UC) 是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，以结肠黏膜连续性、弥漫性炎症改变为特点，病因未明，暂无法治愈。该病病程长，常活动期与缓解期交替出现，活动期以腹痛、腹泻、黏液脓血便为主要临床表现［1］。UC 发病率在我国不断增加，现有的西药因部分存在肝肾损伤、价格较高、停药后易复发等问题，使临床运用受限［2］。近年来，高通量平台在基因表达中的应用在疾病预后、靶向新药研发等临床研究中广泛运用。中药治疗 UC 由来已久，疗效肯定，因此，探讨活动性 UC 中关键分子及寻找出有效中药对改善 UC 的诊断、治疗策略具有重要意义。本文将分析 UC 微阵列技术产生的 2 个数据集，探讨活动性 UC 中关键基因及治疗中药，通过系统性评价对该药临床疗效进行进一步确认，以期为活动性 UC 的中医论治提供新思路。

【资料与方法】

1 芯片数据的获得

      在 GEO( gene expression omnibus) 数据库( ht- tps: / /www． ncbi． nlm) 中下载包含 UC 活动期的基因 芯 片 数 据 ( GSE75214，GSE48959 ) ，其 中GSE75214 芯片数据中包含正常标本 11 例、缓解期标本 23 例、活动期标本 74 例，GSE48959 芯片数据包含正常标本 8 例、缓解期标本 6 例、活动期标本7 例，所有 UC 样本均采自结肠活检病变组织。

2 数据的处理 

      GEO2Ｒ ( http: / /www． ncbi． nlm． nih． gov /geo / geo2r/) 是 GEO 数据库提供的一个基于Ｒ语言的在线分析程序［3］，用 GEO2Ｒ分别比较得出 2 个数据中活动期组与正常组的共有差异基因( 数据集 1) 及活动期与缓解期的共有差异基因( 数据集 2) ，以调整 P( adj． P) ＜ 0. 05 及 | log2 FC | ≥1. 5 为筛选差异基因的标准，其中 log FC≥1. 5 代表基因表达上调， log FC≤－1. 5 代表基因表达下调。将数据集 1 与数据集 2 相映射，最终得出 2 组数据集共有的差异基因，即为活动性 UC 差异表达基因( differentially ex- pressed genes，DEGs ) 。此外，采 用 软 件 HemI 1. 0. 1［4］( http: / /hemi． biocuckoo． org /down． php) 对数据 GSE75214 中 UC 活动期 DEGs 进行热图绘制。 

3 UC活动期DEGs基因本体(gene ontology，GO)分析及京都基因与基因组百科全书( KEGG)分析

      DAVID 数 据 库 ( http: / /david． abcc． ncifcrf． gov /) 是一套完整的功能注释在线工具，供研究者理解大量基因背后的生物学意义［5］。将 UC 活动性DEGs 输入 DAVID 数据库进行 GO 及 KEGG 分析， 以 P＜0. 05 为标准进行筛选。 

4 UC活动期DEGs蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络构建及关键基因分析

      将 DEGs 输入 STＲING( the Search Tool for the Ｒetrieval of Interacting Genes) 数据库( http: / /string- db． org /) ［6］进行蛋白-蛋白相互作用( protein-protein interaction，PPI) 分析，选取得分大于 0. 4 的基因输入 Cytoscape 软件( 3. 2. 1) 进行可视化。应用软件中的 network analysis plugin 对网络图中节点进行统计，分析其在图中的作用———自 由 度 ( degree ) 。degree 越大，该节点在网络中的生物功能越多。根据节点的 degree 算出排名前 10 的基因，即为活动性UC 的关键基因。 

5 治疗UC活动期中药分析

      Coremine Medical 是挪威与中国科学院、中国医学科学院、美国国立医学图书馆等机构联合开发的目前国际上最先进的医学信息检索平台，通过输入基因名，可检索出与该基因相关的疾病及潜在治疗药物。将 活 动 性 UC 的 关 键 基 因 输 入 Coremine Medical 搜 索 框，以 P ＜ 0. 05 为 标 准 进 行 中 药 筛选［7］。将筛选所得的中药进行频次统计，得出频次最高的前 3 味中药。

6 中药系统性评价

     通过查阅相关文献，在上述 3 味中药中挑选合适的 1 味中药，对以该味中药为君药的文献治疗活动性 UC 进行系统评价。 

6.1 文献检索 在英文数据库 Medline，EMbase， PubMed，the Cochrane Central Ｒegister of Controlled Trials( CENTＲAL) 及中文数据库中国期刊全文数据库( CNKI) 、万方数据库、中文科技期刊全文数据库( VIP) 、中国生物医学文献数据库( CMB) ，对上述中药治疗活动性 UC 进行检索，挑选以该味中药为君药的文献进行系统评价，所有数据库检索时间均为建库至 2019 年 9 月。 

6.2 纳入标准 国内外公开发表的随机对照试验，不论是否为单盲、双盲或非盲法，语种局限于中文和英文。研究对象: UC 的诊断标准参照中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组发布的《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》，内镜、组织学等检查提示病情处于活动期[1]，给药途径为口服，不受年龄、性别、病程的限制。试验组干预措施为单纯中药、中成药或中西医联合治疗; 对照组干预措施为西医治疗( 包括水杨酸制剂、激素、免疫抑制剂等治疗) 。 

6.3 排除标准 重复文章; 无全文文章及因资料不全无法进行数据提取的文章; 试验设计不严谨; 动物实验研究。 

6.4 数据提取与质量评价 由 2 位研究者分别独立开展文献检索、纳入及数据提取，使用标准资料提取表提取数据，如有分歧则通过第 3 位确定共识意见。对临床试验方法学质量的评估采用 Jadad 制定的量表［8］，总记分为 1～5 分，1 或 2 分的试验被视为低质量，3～5 分为高质量。采用 the Cochrane Col- laboration 提 供 的 ＲevMan 5. 3 软 件 分 析。计 量 资料、计数资料分别采用均数( mean difference，MD) 、相对危险度( risk ratio，ＲＲ) 为疗效分析统计量，以 95%CI 表示。当 P＞0. 10，I2≤50%时，可认为无异质性，采用固定效应模型分析; 当 P≤0. 10，I2＞50 时，认为有异质性，使用随机效应模型分析并进行亚组分析或敏感性分析。采用漏斗图进行发表性偏倚的检测。如纳入数据不能进行 Meta 分析时，则行描述性分析。

【结果部分】

1 差异基因

      经过初步筛选后发现，GSE75214 中活动期组与正常组相比有 492 个基因，活动期组与缓解组相比有 209 个基因; GSE48959 中活动期组与正常组相比有 476 个基因，活动期组与缓解组相比有 271 个基因。其中 GSE75214 与 GSE48959 活动期组与正常组共有差异基因 379 个( 数据集 1) ，GSE75214 与 GSE48959 中活动期组与缓解组共有差异基因 152 个( 数据集 2) ，数据集 1 与数据集 2 共有差异基因即为 UC 活动性 DEGs 139 个，其中 109 个基因表达上调，30 个基因表达下调，见图 1。GSE75214 中 30个上调基因及 30 个下调基因的热图见图 2，其中红色代表基因表达上调，蓝色代表基因表达下调。

2  活动性UC中DEGs 的GO分析及KEGG pathway富集

3 PPI 网络的构建及关键基因分析

      通过 Cytoscape 软件分析得出活动性 UC 关键基因: 白细胞介素-6( interleukin-6，IL-6) 、趋化因子配体 8( C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8) 、白细胞介素-1β( interleukin-1 beta，IL-1β) 、基质金属蛋白酶-9( matrix metalloproteinase-9，MMP9) 、趋化因子配体 1( C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1) 、细胞间黏附分子-1( intercellular adhesion molecule 1， ICAM1) 、趋化因子配体 10( C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10) 、金属蛋白酶抑制剂 1( metallo- proteinase inhibitor 1，TIMP1) 、前列腺素 G/H 合成酶( prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2) 、趋化因子配体 9( C-X-C motif chemokine ligand 9，CXCL9) ，10个基因均为上调基因，见表3。

4 治疗活动性 UC 的相关中药分析

      在 Coremine Medical 中经过筛选发现，作用活动性 UC 关键基因的中药中出现频次最高的前 3 味是姜黄、黄芩、郁金，其中黄芩入心、肺、胆、大肠经，可清热祛湿、泻火解毒，临床常用于治疗湿热泻痢、诸热肠澼等疾病。UC 活动期病机以湿热、瘀热蕴结肠道为主，故选中药黄芩进行后续系统评价。

5 系统评价文献筛选、质量评价及纳入研究的特征  

    以“黄芩”“溃疡性结肠炎”“活动性溃疡性结肠炎”“溃疡性结肠炎活动期”等关键词在上述数据库中检索，初步检索出 231 篇相关文献。通过阅读摘要和题目排除 160 篇，最终 71 篇文献进行全文阅读，其中符合黄芩为君药的方剂为黄芩汤和芩连理中丸。黄芩汤为《伤寒论》名方，药物组成精当，方中黄芩在整个方中起主导作用，故选用黄芩汤做系统评价。最终筛选出符合条件的文献 10 篇［9-18］，全部为中文文献，总计 777 例患者。文献筛选流程及结果见图 4。其中 10 篇文献，大部分为低质量文献，仅有 1 篇质量评分 为 3 分［17］，见 表 4。10 个 ＲCT 的基本特征见表 5。

6  Meta 分析

1）临床总有效率的 Meta 分析：

2）炎症因子 IL-1β 的 Meta 分析

3）炎症因子 TNF-α 的Meta 分析

4）免疫球蛋白 IgA 的 Meta 分析

5）免疫球蛋白 IgG的Meta分析

7 发表偏倚分析

对临床总有效率为效应指标的研究进行倒漏斗图分析，可见漏斗图基本对称，基本在区间范围内，提示说明不存在明显的发表偏倚，见图 11。

【讨论部分】

综上所述，通过本研究发现，活动性 UC 发病过程与 IL-6，CXCL8，IL-1β，CXCL1 等基因及 TNF 信号通路、NF-κB 通路、Toll 样受体通路等关系密切，中药黄芩对治疗活动性 UC 临床疗效较好，不良反应少。本研究为临床医生对活动性 UC 的诊断及中药治疗提供了一些策略及药物选择。但由于纳入文献数量较少，文献质量较低，有待今后出现更多更好更新的循证医学证据后再进行系统评价以进一步证实。

参考文献略

【如有侵权请联系删除】

【福利时刻】

为感谢您一直以来的支持，本次推文给大家带来一些福利：

      仅需要转发朋友圈或者科研群截图给小编（1278317307）或公众号后台即可获得。

【加入中医药交流群】添加小编微信邀请加入，也可由群友邀请加入，欢迎广大老师、朋友加入我们。

如沐风科研维修站 (Rumfer)公众号：由浙江中医药大学、中国药科大学、江西中医药大学以及福安药业和浙江省疾控中心的硕博士组成，主要发布药物研发、生产及注册，科研实验及前沿咨讯等相关信息。欢迎广大朋友老师关注我们，您的分享和关注是对我们的最大鼓励。