炎症小体NLRP3信号通路调控机制及其小分子靶点抑制剂的研究进展

摘 要：炎症反应是机体常见的生理、病理活动，炎症小体在该反应中发挥重要调控作用。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是炎症小体中关键的调控蛋白之一。研究发现激活NLRP3的刺激因子及其相关分子调控信号通路与多种疾病的发生、发展密切相关，并越来越受到广泛关注，是临床药物研究开发的前沿热点方向。总结NLRP3炎症小体的生物结构、调控功能、信号通路和作用机制等研究进展，并梳理与其相关靶点抑制剂的研究结果，对开展炎症相关疾病的新靶标药物发现及其临床应用研究具有重要的参考价值。

炎症反应是机体受到外界侵害、环境压力下产生的一种应激反应，具有双重调控功能，一方面它可以清除体内受损或死亡细胞，维持机体的健康；另一方面，机体产生的自发炎症、长期慢性炎症会加重病情，并引发一系列并发症^[1-2]。如幽门螺杆菌引起长期胃黏膜炎症，诱发胃癌^[3]；类风湿性关节炎关节滑膜组织长期、慢性无菌炎症会导致关节发炎、疼痛、甚至变形^[4]；新型冠状病毒（SARS-CoV-2）能激活机体释放炎症因子引发细胞因子风暴，导致患者多器官衰竭、死亡^[5]。炎症反应由多种炎症小体诱导引发，炎症小体核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）是关键调控蛋白，深入了解NLRP3在信号通路的作用和调控机制对疾病预防、药物发现具有重要的研究指导意义。

NLRP3依据蛋白的结构和功能可划分为PYD、NACHT、LRR 3个部分。位于N-端的PYD区域可以与其他蛋白PYD结构域结合，形成PYD-PYD复合物，从而激活下游反应，具有募集和连接作用。如与ASC末端PYD区域结合形成NLRP3-ASC复合物^[6]。NACHT与ATP结合，可将其水解为二磷酸腺苷ADP释放能量，并对NLRP3下游蛋白发挥重要调控功能；LRR区域富含高度保守的亮氨酸重复序列，具有正电性，激活后可通过离子能与无丝分裂基因A（neverin mitosis gene A，NIMA）相关蛋白激酶7（NIMArelated kinase 7，NEK7）形成NEK7-NLRP3复合物，易被泛素化修饰，导致NLRP3自身抑制^[7]。见图1。

1  NLRP3经典活化通路的调控和抑制

1.1  NLRP3经典信号通路调控机制

静息状态下吞噬细胞中NLRP3的含量很低，多以泛素化无活性、稳定状态存在^[9]。NLRP3的经典活化一般由Toll样受体4（toll-likereceptor 4，TLR4）在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的刺激下与胞内髓样分化分子2（myeloiddifferentiation factor 2，MD-2）形成（TLR4/MD-2/LPS）₂六聚体复合物^[10]，通过髓样分化因子(myeloid differentiationfactor88，MyD88）激活IL-1受体相关激酶（IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）/肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体相关因子6（TNFreceptor associated factor 6，TRAF6）通路，促进核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）入核。

NLRP3的刺激因子结构、来源均具有多样性的特点，如病毒RNA、真菌菌丝、过量ATP、透明质酸、活性氧自由基（ROS）等；此外细胞内外阳离子的跨膜流动、β-淀粉样蛋白、尿酸盐结晶等也能驱动NLRP3激活，引起体内无菌性炎症。如图2区域B所示，NLRP3刺激因子能促使细胞内的高尔基体反面网络结构（trans-golgi network，TGN）解体，形成分散的小型囊泡状特殊结构（dTGN），随后dTGN膜上富集的负电性磷脂磷脂酰肌醇-4-磷酸激酶（phosphatidylinositol-4-phosphate，PtdIns4P）通过离子能吸引LRR区域，招募细胞质基质内的无活性NLRP3，组装形成完整的NLRP3蛋白^[11]。

NLRP3在经dTGN募集后，继续进一步经去泛素化、乙酰化活化，也可经引入磷酸基团而失活。SIRT2属于Sirtuin家族，可通过抑制NLRP3的乙酰化活化而抑制NLRP3/ASC/caspase-1复合物的形成，达到抑制炎症的目的。SIRT2酶含量和活性会随年龄的增长而下降，这也是老年人群免疫系统失衡疾病高发的主要影响因素^[12]。

NLRP3的LRR区域会吸引NEK7的C-端形成NLRP3-NEK7复合物，随后进一步吸引ASC等相关蛋白形成NLRP3/ASC/caspase-1复合物。NLRP3活化后，N-端的PYD与ASCN-端的PYD相连，再通过ASC蛋白C-端的CARD区域，招募caspase-1的前体、使其自剪切活化，并与其CARD端连接形成NLRP3复合物。NLRP3复合物可以剪切pro-IL-1β、pro-IL-18为IL-1β、IL-18，使其释放到胞外，令其他吞噬细胞响应；活化的caspase-1也可剪切GSDMD前体，GSDMD的N-端可引起膜孔形成，形成IL-1β的释放通道，并可使细胞焦亡^[8]。

POPs是一段仅含PYD序列的小蛋白分子，目前已经证实了POP1、POP2、POP4 3种亚型可以抑制NLRP3信号通路。COPs是仅含CARD序列的蛋白，目前发现的COPs有Inca、Iceburg、caspase-12等，这些均与caspase-1的CARD序列有极高的相似性，可以阻止NLRP3复合物的形成^[13]。

1.2  NLRP3启动转录阶段的抑制

吞噬细胞膜外受体接受刺激因子刺激并NF-κB入核上调炎症相关蛋白表达是NLRP3启动转录的关键步骤。Z20靶向结合于TLR4/MD-2，抑制炎性因子分泌、炎症反应，从而有效减轻LPS诱导的小鼠器官损伤，提高脓毒血症小鼠模型的存活率^[14]。T5342126是一种新型小分子TLR4抑制剂，靶向结合TLR4，阻止TLR4与MD-2形成复合物，抑制TLR4的活性，还能有效增强吗啡的镇痛效果^[10]。姜黄素（curcumin）与MD-2分子的疏水口袋结合，阻断TLR4/MD-2复合物的形成，下调NF-κB的激活^[15]。E5564能抑制TLR4/NF-κB信号通路，减轻痛风患者针状尿酸结晶引起的巨噬细胞NF-κB信号通路的激活，产生有效的抗炎作用^[16]。miR-233可通过直接靶向IRAK1的基因序列，抑制NF-κB的激活，从而产生抑制炎症的效果^[17]。去泛素化酶A20可以招募TNFR1并裂解其上Lys-63-连接的多泛素链，使其去泛素化失活，从而抑制NF-κB的激活^[18]。BAY-117082选择性、不可逆地抑制IKK活性，对致心律失常性心肌病模型小鼠具有显著地抗炎活性。硼替佐米（bortezomib）能抑制IκB基团泛素化，下调NF-κB活性，缩小肺腺癌小鼠体内肿瘤体积，此外临床已证实服用硼替佐米的多发性骨髓癌患者，存活率改善显著^[19]。

1.3  NLRP3/ASC/casepase-1复合物形成的抑制

NLRP3/ASC/casepase-1复合物的形成可以利用POPs、COPs通过竞争结合来抑制，也可通过阻止蛋白质去泛素化、磷酸化等活化作用抑制复合物的形成以达到抗炎的目的。VX-765、Ac-YVAD-cmk均是caspase-1的选择性抑制剂，实验证明VX-765可显著抑制polyphyllin VI引起的NLRP3炎症小体激活、细胞死亡^[20]，Ac-YVAD-cmk则可通过这一通路改善脑卒中小鼠的认知功能，恢复其海马体体积^[21]。b-AP15靶向结合于DUBs中的UCH37、USP14亚型，抑制LPS引起的IL-1β分泌、减少尼日利亚菌素引起的细胞死亡；WP1130靶向4个DUBs亚型，具有与b-AP15类似的活性。有研究认为它们也能通过抑制caspase-1的p10亚单位脱落而抑制caspase-1通路，从而阻碍复合物形成^[22]。胆汁酸受体（TGR5）激动剂桦木酸（betulinic acid）、INT-777、LCA可以通过上调TGR5/cAMP/PKA通路激活PKA激酶，从而在此处引入磷酸基团使NLRP3失活，起到抗炎效应^[23]。MCC950已经通过药物亲和力靶稳定性等实验证实，其靶向NLRP3蛋白NACHT区域上的一小段称为Walker B的区域，使其构象发生变化，从而抑制NLRP3活性，且对LPS、结核分支芽孢杆菌等引起的炎症都有明显抑制效果^[24]。

2  NLRP3的其他调控通路

2.1 NLRP3非经典活化通路的调控

如图2区域C所示，caspase-4、5、11 3种蛋白可被胞内细菌内毒素激活，促使NLRP3/ASC/ caspase-1复合物释放IL-1β、IL-18，此外，这3种蛋白也可直接作用于GSDMD^[25]，产生与经典活化通路类似的效应。emricasan已被证明可以抑制肝脏炎症和纤维化，有效缓解酒精引发的肝硬化^[26]。

2.2  跨膜离子的流动对NLRP3的影响和抑制

胞内各蛋白复合物的含量对比实验数据表明，K⁺外流可以驱动NLRP3的聚集，而Cl^-外流则是促进ASC的聚合^[27]。如图2区域D所示，抑制离子流动可对NLRP3的激活起到抑制作用。部分NLRP3激动剂如咪喹莫特（imiquimod）、CL097是通过引起K⁺外流而激活的NLRP3^[28]。NPBB是Cl⁻通道阻滞剂，可以将胞内Cl⁻维持较低水平，从而抑制NLRP3的激活；抗血小板药替格瑞洛（ticagrelor）作用于Cl⁻通道，通过诱导通道蛋白发生降解和抑制氯离子通道蛋白的细胞膜定位抑制了Cl⁻的外流^[29]，达到了抑制NLRP3激活的效果。

2.3  内质网相关蛋白对NLRP3的影响和抑制

SREBP2、SCAP位于内质网上，两者通过形成NLRP3/SREBP2/SCAP三元复合物“护送”NLRP3由内质网易位到高尔基体膜上，优化了炎症小体组装过程。ESI的硝基呋喃基团靶向作用于内质网，干扰其稳态，通过影响caspase-1的合成减少IL-1β的分泌，从而产生类似硼替佐米的抗癌效果^[22]。特布他林（terbutaline）、fatostatin、25-HC在细胞水平、小鼠体内实验中均可抑制内质网上SREBP2/ SCAP通路，影响NLRP3的组装，抑制LPS引起的炎症反应^[30]。

2.4  线粒体及相关蛋白对NLRP3的影响和抑制

静息状态下NLRP3定位于内质网，ASC则散布于胞质内。如图2区域D所示，细胞受到外界刺激后，线粒体膜上的MAVS蛋白会通过与NLRP3的N-端相作用将NLRP3、ASC招募到一起，促进其活化，MAVS蛋白是NLRP3活化的一个重要蛋白，敲除MAVS基因的小鼠能显著抑制LPS引起的IL-1β水平增高。microRNA-33/33*是胆固醇稳态的重要调控因子，能通过靶向AMPK进行转录后沉默，干扰线粒体内部稳态，降低MAVS活性，阻碍其对NLRP3、ASC的召集^[31]。此外，线粒体损伤会释放ROS，激活NLRP3小体，线粒体的自噬可以抑制炎症小体的活化。胆碱激酶（ChoK）抑制剂可以促进线粒体自噬，停止胆碱的摄取。LPS诱导的巨噬细胞经RSM932A处理后，能显著抑制炎症效应，有效缓解小鼠Muckle-Well综合征的症状^[32]。

2.5  炎症细胞因子对NLRP3的影响和抑制

炎症细胞因子是由免疫细胞经激活后分泌到胞外的内源性物质，可对周围其他免疫细胞产生激活或抑制效应。卡那奴单抗（canakinumab）是一种完全人源的单克隆IgG1/k抗体，用于治疗多种IL-1介导的炎症性疾病，可通过选择性地结合游离IL-1β，阻断其与IL-1R的相互作用，从而抑制IL-1β的活性，在多种疾病模型的临床实验中具有显著的抗炎作用，如隐索蛋白相关周期性综合征（CAPS）、系统性幼年特发性关节炎（sJIA）、肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征（TRAPS）等^[33]。

TNF-α单抗如依那西普（etanercept）、阿达木单抗（adalimumab）和英夫利昔单抗（infliximab）可与游离胞外的TNF-α结合，抑制NLRP3的激活。临床上已经证实阿达木单抗对银屑病、克罗恩病等免疫异常介导的慢性病疗效显著^[34]。IL-10靶向降低NLRP3的翻译表达，抑制炎症效果显著，但其体内半衰期短、易失活；聚乙二醇化的IL-10抑制剂pegilodecakin可延长IL-10受体的刺激时间，发挥显著抗炎作用，与抗PD-1单克隆抗体抑制剂联合用药的安全性、有效性评价正开展临床实验^[35]。

3  结论与展望

NLRP3的激活因子多种多样，该通路与众多疑难疾病发生、发展密切相关，探索新型的NLRP3抑制剂研究具有广泛的应用前景，如抑制NLRP3炎症小体活性可显著减轻急性肾损伤、脓毒症心肌炎损伤^[36-37]。近年来炎症小体NLRP3的调控机制研究已成为前沿热点，小分子抑制剂MCC950首次证实可直接作用于NLRP3产生抑制活性，受到重点关注。深入理解炎症反应的生理、病理过程，并根据其激活途径探寻新靶点、高选择性的抑制剂可为治疗重大炎性相关疾病提供全新的思路。

参考文献（略） 

来  源：   穆瑞旭，勾文峰，魏会强，侯文彬，李祎亮，朱  蕾. 炎症小体NLRP3信号通路调控机制及其小分子靶点抑制剂的研究进展 [J].  现代药物与临床, 2020, 35(10).2283-2287.

【转自中草药公众号】

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