附子-干姜对慢性溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜微循环障碍的改善作用

如沐风科研

摘要：目的研究附子-干姜对慢性溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）小鼠肠黏膜微循环障碍的改善作用。方法建立慢性UC小鼠模型，给予附子-干姜水煎液进行干预，记录各组小鼠体质量、大便性状及便血情况，进行疾病活动指数（disease activityindex，DAI）评分；采用激光多普勒血流仪检测各组小鼠肠黏膜血流灌注量、血细胞移动速度和移动血细胞浓度；采用ELISA法检测各组小鼠血清中血小板活化因子（platelet activatingfactor，PAF）和组织因子（tissue factor，TF）水平；采用苏木素-伊红（HE）染色法观察各组小鼠结肠组织病理改变情况；采用免疫组化法检测各组小鼠肠黏膜毛细血管内皮细胞CD31表达并计算微血管密度（microvessel density，MVD）。结果与对照组比较，模型组小鼠DAI评分显著增加（P＜0.01），肠黏膜血流灌注量、血细胞移动速度显著下降（P＜0.01），肠黏膜移动血细胞浓度显著升高（P＜0.01），血清PAF、TF水平显著升高（P＜0.01），结肠组织CD31表达减少，肠黏膜微血管密度显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，附子-干姜高剂量（6.06 g/kg）组小鼠DAI评分明显降低（P＜0.01），肠黏膜血流灌注量、血细胞移动速度显著升高（P＜0.01），肠黏膜移动血细胞浓度显著降低（P＜0.01），机体凝血因子PAF、TF水平显著降低（P＜0.01），肠黏膜MVD显著增加（P＜0.01）。结论附子-干姜可通过改善肠黏膜微循环障碍从而治疗慢性UC。

溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，UC）是一种与炎症相关的慢性结直肠疾病，病变呈连续性。目前认为慢性UC的发病机制主要为先天免疫和适应性免疫，以及遗传因素与微生物和环境因素之间的相互作用^[1]。慢性UC发病率在全球范围内呈上升趋势，患者病理表现为腹痛、腹泄、黏液血便等症状，生活质量受到严重影响^[2]。UC患病率的增加会增加结直肠癌患病风险。慢性UC患者血液呈高凝状态，血栓形成风险高，易导致肠黏膜微循环障碍，进而介导和放大肠黏膜损伤炎症，表明慢性炎症与微循环障碍之间存在着密切联系^[3-4]。因此改善肠黏膜微循环障碍可能是治疗慢性UC的有效方法。

中医认为慢性UC属“泄泻”“久痢”“休息痢”“肠癖”等范畴，病位多以大肠为主，涉及脾、胃、肝、肾等脏腑，病理因素常伴有阳虚、血虚、气滞、血瘀等证。慢性UC病机多以脾肾阳虚为主，久病不愈、阳气已虚致使气血不足、血瘀肠络，治疗多加用炮姜、熟附子温补脾肾、温通经脉^[5-8]。因此，中医认为慢性UC与血瘀之间存在密切关系^[9]。

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliiDebx.的子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、温阳通脉的功效，其性刚烈迅捷、走而不守，能通上达下、行表彻里、通行十二经脉，破癥坚、积聚、血瘕等^[10-13]。附子无姜不热，常与干姜配伍使用^[14]。二者配伍在临床上常可治疗慢性肠炎、克隆恩病、慢性胃炎等慢性疾病。课题组前期研究发现^[15]，制附子与干姜配伍对肾上腺素所致小鼠耳廓微循环障碍具有良好的改善作用。现代药理学研究表明，附子与干姜配伍具有改善微循环、增加血流速度、提高血流量的作用^[16-17]。本研究采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）制备慢性UC模型，观察附子-干姜对慢性UC小鼠血清血小板活化因子（platelet activatingfactor，PAF）、组织因子（tissue factor，TF）的水平以及肠黏膜微血管密度（microvessel density，MVD）、肠黏膜血流灌注量、血细胞移动速度、移动血细胞浓度的影响，为附子-干姜防治慢性UC肠黏膜微循环障碍提供依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠60只，6～8周龄，体质量20～22 g，购自甘肃中医药大学实验动物中心，合格证号SCXK（甘）2015-0002，饲养于甘肃中医药大学实验动物中心SPF级动物房，温度18～22 ℃，相对湿度50%～60%。动物实验经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号2019-195）。

1.2 药材

制附子购自河北安草堂药业有限公司，干姜购自河北百合药业有限公司，经甘肃中医药大学药学院中药鉴定教研室李成义教授分别鉴定为毛茛科植物乌头A. carmichaelii Debx.的子根的加工品、姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎。

1.3 药品与试剂

固本益肠片（0.32 g/片，批号20191203）购自沈阳绿洲制药有限公司；DSS（批号D7002900）购自上海翊圣生物有限公司；小鼠PAF ELISA试剂盒（批号20200909A）、小鼠TF ELISA试剂盒（批号20200909A）购自上海酶联生物有限公司；CD31抗体（批号25u3337）购自美国Affnity公司；4%多聚甲醛通用组织固定液（批号XS190204）购自北京白鲨易科技有限公司；人尿粪隐血测定试剂盒（批号H-F01）购自南京建成生物工程研究所。

1.4 仪器

台式电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏设备公司）；包埋机（浙江省金华市科迪仪器）；切片机、DM2500显微镜（德国Leica公司）；SHA-C水浴锅（江苏荣华公司）；iMark酶标分析仪（美国Bio Rad公司）；MoorVMS-LDF激光多普勒血流仪（英国Moor Instruments公司）；Biofuge Stratos高速冷冻离心机（美国科峻仪器公司）。

2 方法

2.1 附子-干姜提取液的制备

根据课题组前期研究^[15]，附子-干姜比例为1∶1，称取附子、干姜各100 g，附子加10倍量水浸泡1 h，先煎1 h，再与干姜合煎30 min，滤过；连续煎煮3次，合并3次滤液，于水浴锅上浓缩至200 mL，质量浓度为1g/mL（以生药量计），于−20 ℃保存。

2.2 分组、造模与给药

小鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组、模型组、固本益肠（1.16 g/kg）组及附子-干姜高、中、低剂量（6.06、3.03、1.51 g/kg）组，每组10只。对照组小鼠给予饮用水，其余各组连续给予2% DSS水溶液5 d，自第6天开始自由饮用水5 d，此为1个循环，如此反复进行3个循环，共30 d，建立小鼠慢性UC模型^[18]。附子-干姜提取液以蒸馏水稀释至质量浓度为0.30、0.15、0.08 g/mL的溶液，分别用作附子-干姜高、中、低剂量组；固本益肠片溶于无菌蒸馏水配制成质量浓度为0.06 g/mL的溶液。第31天各给药组ig相应药物（20 mL/kg），对照组与模型组ig等体积生理盐水，1次/d，连续10 d。每天观察各组小鼠精神状态、饮食、饮水情况，记录小鼠体质量、大便性状及便血情况，进行疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分。体质量下降率评分标准：0分为体质量不变；1分为下降1%～5%；2分为下降6%～10%；3分为下降11%～15%。大便性状评分标准：0分为正常；2分为大便松散；4分为稀便。便血评分标准：0分为正常；2分为潜血阳性；4分为肉眼血便。

DAI＝(体质量下降率评分＋大便性状评分＋便血评分)/3

2.3 附子-干姜对慢性UC小鼠肠黏膜血流灌注量、血细胞移动速度和移动血细胞浓度的影响

小鼠末次给药后禁食不禁水1h，ip 4%水合氯醛麻醉，将小鼠仰卧固定于实验台，在腹正中线作2～3 cm切口，暴露结肠，选择距肛门2～4 cm处为下端观察区，4～6 cm处为上端观察区，排除剧烈振动、心跳和呼吸对实验的影响。在暴露肠断面覆以纱布，用温盐水湿润，然后将光纤探头轻轻放在观察区结肠表面，稳定5 min后进行观测。取10 s的平均值，在检测开始15 s时记录血流灌注量、血细胞移动速度和移动血细胞浓度。将观察区上下端所测得的值取平均值作为整个结肠的血流灌注量、血细胞移动速度和移动血细胞浓度值。

2.4 附子-干姜对慢性UC小鼠血清中PAF和TF水平的影响

小鼠末次给药后禁食不禁水1h，眼眶取血，3000r/min离心10 min，收集血清，按照试剂盒说明书检测小鼠血清中PAF和TF水平。

2.5 附子-干姜对慢性UC小鼠结肠组织病理变化的影响

小鼠末次给药后禁食不禁水1h，脱颈椎处死，取结肠组织，清洗后于4%多聚甲醛中固定48 h，脱水、常规石蜡包埋、切片，附于高黏附载玻片上，于37 ℃过夜，苏木素-伊红（HE）染色，于显微镜下观察结肠组织损伤变化。

2.6 附子-干姜对慢性UC小鼠肠黏膜MVD的影响

取各组小鼠结肠组织，清洗后于4%多聚甲醛中固定，脱水、常规石蜡包埋、切片。石蜡切片脱蜡后，加入3% H₂O₂阻断内源性氧化酶并用枸橼酸抗原修复15 min，5%BSA封闭30 min，滴加一抗（1∶100），37℃复苏35 min，PBS洗涤5 min，滴加生物素化的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；DAB显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、封片后，于显微镜下观察并拍照。CD31阳性表达呈棕褐色或棕黄色颗粒。在100×视野下观察组织切片，选择3个肠黏膜绒毛上微血管较多处，即热点区；再于200×视野下计数热点区微血管数目，求3个视野的平均值，作为肠黏膜绒毛组织的MVD^[19]。

2.7 统计处理

采用SPSS 23.0软件分析，实验数据以表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行各组间差异比较。

3 结果

3.1 附子-干姜对慢性UC小鼠DAI评分的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组小鼠DAI评分显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组DAI评分显著降低（P＜0.01）。

3.2 附子-干姜对慢性UC小鼠结肠组织病理变化的影响

如图1所示，与对照组比较，模型组小鼠结肠黏膜炎性细胞浸润明显，腺体排列损伤严重，层次不清，肠上皮细胞再生严重、淋巴组织异常增生。各给药组小鼠结肠组织结构趋于完整，杯状细胞明显增多，炎性细胞浸润明显减少，腺体结构趋于完整，增生组织明显较少。

3.3 附子-干姜对慢性UC小鼠肠黏膜血流灌注量、血细胞移动速度和移动血细胞浓度的影响

如表2所示，与对照组比较，模型组小鼠肠黏膜血流灌注量、血细胞移动速度显著下降（P＜0.01），移动血细胞浓度显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，固本益肠组、附子-干姜高剂量组小鼠肠黏膜血流灌注量、血细胞移动速度显著升高（P＜0.01）、移动血细胞浓度显著下降（P＜0.01）；附子-干姜中剂量组小鼠肠黏膜血流灌注量、移动血细胞速度显著升高（P＜0.05）。

3.4 附子-干姜对慢性UC小鼠血清中PAF和TF水平的影响

如表3所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中PAF和TF水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中PAF和TF水平均显著降低（P＜0.05、0.01）。

3.5 附子-干姜对慢性UC小鼠肠黏膜MVD的影响

如图2所示，CD31阳性表达均定位于血管内皮细胞胞质，呈棕褐色颗粒或棕黄色。对照组小鼠肠黏膜结构清晰，CD31表达阳性的棕褐色颗粒分布于肠绒毛的中轴，数量较多；模型组小鼠肠黏膜结构及肠绒毛可见边缘缺损，炎性细胞浸润明显，CD31表达阳性的棕褐色颗粒在肠绒毛的中轴分布不均，颗粒较少；各给药组小鼠肠黏膜可见较多的棕褐色颗粒。

如表4所示，与对照组比较，模型组小鼠肠黏膜MVD显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，固本益肠组及附子-干姜高、中剂量组小鼠肠黏膜MVD显著升高（P＜0.05、0.01）。

4 讨论

UC是消化系统中最常见的一种慢性疾病，常自结肠近端发展至全结肠导致黏膜损伤^[20]。慢性UC患者5年内结肠切除的风险为10%～35%，我国UC的患病率为0.011 6%^[21-22]。目前临床上主要以5-氨基水杨酸药物、类固醇类、免疫抑制剂、生物制剂等基本药物联合肝素维持治疗慢性UC，但因联合用药复杂，治疗效果不佳，UC复发率极高、不良反应较多。因此，寻找更为有效的治疗UC药物尤为重要。中医药通过辨证治疗慢性UC，具有不良反应小的优点^[23]。近年来有应用中药复方、中药单味药联合西药或者仅通过针刺改善微循环而治疗UC的相关报道^[24-26]，但因其复方药味复杂，改善微循环机制不明确或者针刺治疗方式单一，近期症状缓解效果良好，但远期疗效不佳。附子-干姜来源于《三因极一病证方论》中的附子理中汤，具有温中散寒、补气健脾的功效，主治久病不愈、寒凝不化、肠鸣即泻等症，方中发挥主要作用的附子-干姜具有抗溃疡、抗炎、改善微循环等作用。

中医认为“瘀”是UC的主要病因病机，病理基础以脾肾阳虚为本、以“瘀”为标，表明UC病程较长，缠绵难愈，久病必有瘀，血瘀的产生必然加重UC的病情和复杂性^[27-28]。久泻伤肾则肾阳不足，脾阳无以温煦，气血瘀滞，化腐成脓，故导致腹痛、黏液脓血便。因此，可以用附子-干姜补肾阳间接化瘀从而改善脾肾阳虚、瘀血阻滞，从本质上治疗慢性UC。本研究结果显示，附子-干姜可改善慢性UC小鼠皮毛光泽度、饮食饮水量及弓背、脓血便等症状，提示附子-干姜在改善慢性UC的临床症状中具有明显的优势。

肠黏膜局部的血液循环是黏膜局部防卫能力的重要组成部分。良好的血液循环，是提供丰富的营养和祛除有害代谢物质的重要保证，对黏膜的完整性起重要作用^[29]。目前，肠黏膜微循环障碍是慢性UC临床研究中的热点。慢性UC疾病使机体凝血系统异常、炎症活化、凝血功能障碍，肠黏膜微血栓形成，肠黏膜血流灌注量减少，加重肠黏膜组织缺血、坏死，形成溃疡，出现便血症状^[30-31]。肠道炎症可引起机体的抗凝系统紊乱、血小板功能改变，导致肠黏膜及其他部位血栓的形成。慢性UC肠黏膜活检病理组织学中常见大量黏膜毛细血管血栓形成^[32]。血栓形成使肠黏膜通透性改变，肠黏膜供血减少，使肠腔内的有害物质进入血循环，黏膜毛细血管破坏，进而使肠黏膜受损，诱导黏膜发生异常炎症反应^[33]。慢性UC炎症状态可通过局部释放血小板活化物（如TF、PAF）并激活其他炎症细胞，使血液呈血栓状态，阻塞肠黏膜微循环，加重肠黏膜缺氧损伤，形成恶性循环，使慢性UC反复发作^[34]。化学趋化物PAF在局部微循环障碍病理过程中起重要作用^[35]。PAF的主要作用是刺激血小板，促进血小板聚集，引起中性粒细胞聚集，增加血管通透性，加剧炎症发生^[36]。TF在生理性止血和血栓形成中起着重要的作用。在某些诱因作用下凝血系统TF从内皮细胞释放，与凝血因子结合形成复合物后被活化，诱发机体血液呈高凝状态^[37]。TF在慢性UC结肠组织中呈高表达水平^[38]。因此，PAF、TF可作为检验炎症状态下机体是否有凝血状态的指标。本研究结果显示，附子-干姜可显著降低慢性UC小鼠血清中PAF和TF水平，减少慢性UC机体血栓的形成。机体微血栓形成会使肠黏膜组织微循环血流灌注量减少，血细胞移动速度减慢直至停止，移动血细胞浓度上升，因此血流灌注量、血细胞移动速度、移动血细胞浓度是了解组织微循环状态的重要指标^[39]。移动血细胞浓度与组织中细胞的数量有关，可反映血细胞的聚集程度。血细胞移动速度是微循环的实时动态，可反映微循环血流灌注量的情况。血流灌注量与血流速度呈正比，血流灌注量的降低主要由血流速度变慢、移动血细胞浓度增高造成^[40]。激光多普勒血流仪是微循环血流测量中无创、敏感、重复性较好的检测设备，可以实时动态观察血流的变化^[41-43]。本研究结果显示，附子-干姜能显著改善慢性UC小鼠肠黏膜移动血细胞浓度，加快血流速度，减少红细胞聚集，提高肠黏膜微循环血流灌注量影响。肠黏膜微循环血流灌注量减少，就会使肠黏膜功能毛细血管破坏。CD31是一种血小板内皮细胞黏附分子，可以准确地标记新生微血管的数目和密度^[44]。本研究结果显示，慢性UC状态下肠黏膜MVD显著降低，附子-干姜高剂量组小鼠肠黏膜MVD显著增加，表明附子-干姜能够保护肠黏膜功能毛细血管内皮细胞，增加肠黏膜功能毛细血管密度。

综上，本研究发现附子-干姜能够降低机体凝血系统的紊乱，保护慢性UC肠黏膜毛细血管内皮细胞，增加肠黏膜毛细血管密度，增加肠黏膜血流灌注量，加快血细胞移动速度，降低移动血细胞浓度，促进肠黏膜修复，改善肠黏膜微循环障碍。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：翟勇聪，夏顺利，王雪，臧凯宏，韩涛．附子-干姜对慢性溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜微循环障碍的改善作用 [J]. 中草药, 2021, 52(7): 1987-1993 .

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