北京天坛医院神经外科人脑肿瘤生物样本库中组织样本RNA的质量评价|【中华神外】2016年第五期“颅内肿瘤”
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今天刊登的是李奇、乔琳、李子瑞、王雅杰等在《中华神经外科杂志》2016年第五期上发表的《北京天坛医院神经外科人脑肿瘤生物样本库中组织样本RNA的质量评价》，欢迎阅读。
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脑肿瘤是严重危及人类生命的肿瘤性疾病之一，多年来一直是神经外科临床和基础研究领域最受关注的问题。其中以胶质瘤为代表的恶性脑肿瘤手术治愈率较低，生存期甚短，尽管手术、放疗及化疗等治疗技术的不断进步，但临床治疗效果并未显著改善[1]。研究脑肿瘤生物学特性、临床治疗的有效性、防止肿瘤的复发是亟待解决的难题。临床和影像学资料完善的脑肿瘤组织标本是其基础和临床研究的宝贵资源，是肿瘤领域转化研究的基石[2-3]。为此，首都医科大学附属北京天坛医院神经外科在2010年11月建立了院级规范化脑肿瘤生物样本库。
脑肿瘤生物样本库，是系统收集和存储手术切除的脑肿瘤组织、血液等样本并整合标本病理类型、临床信息和治疗效果的综合研究平台，建设内容主要包括：
①标本的收集、处理、储存的标准流程；
②临床信息收集；
③脑肿瘤生物样本库的质量控制[4]。
样本长期保存，许多组织会发生降解，其中以RNA较为严重[5]。为了检测脑肿瘤生物样本库中组织样本RNA的质量，本研究依据年份随机抽取100份肿瘤组织样本，提取总RNA进行质量监测。
材料与方法
1. 组织样本的收集与保存：样本来源为北京天坛医院脑肿瘤生物样本库中的组织样本，收集2011年1月至2015年12月神经外科接受手术治疗的脑肿瘤患者的标本，每年度随机抽取20份，共100份肿瘤组织样本。样本收集和保存方法：在保证病理学诊断的前提下，收集剩余的组织标本，用预冷的PBS缓冲液清洗样本表面的血液及坏死组织，在无菌条件下将标本切成小块（约0.5cm×0.5cm大小，厚度＜0.5cm），液氮速冻，分装于冻存管中并标记，离体的组织样本保证在30min内放入手术室液氮罐中暂存，当天转入样本库液氮罐中长期保存，做好样本入库后的登记工作，在随后的临床诊治中确定病理诊断结果并记录。
2. 组织样本总RNA的提取：使用Trizol （Invitrogen）试剂提取脑肿瘤组织样本总RNA，按照试剂说明书进行操作，主要实验步骤如下：每100mg组织中加入1ml Trizol，自动匀浆器匀浆至无明显组织块；加氯仿200μl，剧烈振摇15s，室温放置5min，4℃，12000×g，离心15min；将上层水相转移至新离心管中，加入0.5ml异丙醇（与吸取水相等体积），上下颠倒混匀，冰上放置10min，12000×g，4℃离心10min；弃上清，加入1ml75%乙醇（DEPC水处理），充分混匀，洗涤沉淀，7500×g，4℃离心10min；弃上清，可见白色沉淀，室温干燥10min，加50μl DEPC水溶解RNA。
3. 样本RNA的纯度和浓度检测：使用Biospec Nano核酸分析仪（Shimadzu Spectrophoto meter）检测样本RNA的纯度和浓度，每个样本上样量为1μl。A260值作为RNA浓度测定的指标，浓度以ng/μl为单位。A260/A280和A260/A230的吸光度比值作为RNA纯度的指标。
4. 样本RNA完整性检测：通过RNA非变性电泳，鉴定样本RNA的完整性。用DEPC水配制1.0%浓度的TAE琼脂糖凝胶，样本RNA上样量为500ng，根据RNA浓度，计算样本RNA的上样体积；将RNA、DEPC水、6×上样缓冲液混匀后上样，使用TAE电泳缓冲液在80V电压下电泳，电泳结束后，溴化乙锭染色，在紫外灯下观察结果，使用凝胶成像仪拍照记录。
5. 样本RNA的反转录反应：将1μg总RNA反转录为cDNA，用于后续实时定量PCR分析。基因组DNA的去除及反转录反应采用Prime Script RT reagent Kit Withg DNA Eraser试剂盒（TaKaRa）。具体方法如下：RNA 1μg，5×gDNA Eraser Buffer 2μl，gDNA Eraser 1μl，补水至10μl；42℃反应5min，冷却至4℃。在上述反应液中加入5×Prime Script Buffer 4μl，Prime Script RT enzymeMix1μl，RT Primer Mix1μl，补水至20μl；37℃反应15min，85℃反应5s，4℃保存。
6. 实时定量PCR检测管家基因GAPDH和ACTB表达：以提取的总RNA，逆转录成的cDNA为模板，进行实时定量PCR，扩增2个管家基因GAPDH和ACTB。PCR反应按照SYBR Premix EX Taq Ⅱ试剂盒（TaKaRa）说明书进行，配制20μl反应体系：SYBR Premix EX Taq Ⅱ 10μl，Housekeeping Gene Primer 1.6μl，cDNA模板2μl，水6.4μl。利用Thermal Cycler Dice Real Time System（TaKaRa）仪器进行实时定量PCR扩增，反应条件如下：95℃ 30s，95℃ 5s，58℃ 30s，72℃ 30s，延伸阶段收集荧光信号，重复40个循环；55～95℃绘制溶解曲线。反应结束后确认实时定量PCR的扩增曲线和融解曲线。每个样本重复3遍。GAPDH定量PCR引物序列：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；ACTB定量PCR引物序列：上游5′-TTAGTTGCGTTAC ACCC-TTTCTTG-3′，下游5′-GTCACCTTC ACCGTTCCAG-TTTT-3′；引物委托上海英维捷基公司合成。
7. 统计学方法：所有数据采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，各组数据采用`X±s表示，结果采用t检验进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1. 不同储存时间脑肿瘤样本组织提取的总RNA纯度和浓度：
①总RNA纯度的检测结果：2011年度样本RNA的A260/A280比值为2.22±0.24，该均值＞2.2，表明部分样本RNA有降解；2012年度至2015年度样本RNA的A260/A280比值分别为2.07±0.12、1.95±0.17、1.93±0.15、1.88±0.07，均在1.8～2.1，表明RNA纯度较好；A260/A230比值分别为2.10±0.12、2.08±0.09、2.04±0.07、2.06±0.08、2.07±0.06，A260/A230均＞2.0，表明所提取的RNA没有盐离子和有机溶剂等物质的污染。
②总RNA浓度的检测结果：2011年度至2015年度样本RNA浓度分别为513.34ng/μl、507.77ng/μl、501.52ng/μl、504.93ng/μl、510.17ng/μl，表明所提取的100份组织样本总RNA浓度一致性较好，说明RNA提取方法和实验过程准确，结果可靠。
2. 不同储存时间脑肿瘤样本组织提取的总RNA完整性：非变性RNA电泳结果显示，在2011年度样本RNA中，有15份RNA，28S和18S条带不清晰，有拖尾和弥散分布的条带，5S条带较明显，提示RNA有部分降解（图1A）；在2012年度至2015年度80份样本RNA中，分别有15份、17份、18份、20份样本RNA，可见明显的28S和18S条带，而且28S的亮度为18S条带亮度的1.5～2.0倍，表明RNA完整性较好（图1B～E）。2011年度至2015年度收集的组织样本，提取总RNA，合格率分别为25%、75%、85%、90%、100%。结果提示，使用2012年度至2015年度收集的组织样本，即储存4年的标本，大部分样本RNA完整性较好，无降解，经质量评估后，合格样本用于后续RNA水平的研究。
图1. 首都医科大学附属北京天坛医院2011年度至2015年度收集的脑肿瘤组织样本提取的总RNA完整性分析，脑肿瘤组织样本RNA非变性电泳例图。A. 2011年度，1~5号样本总RNA降解明显；B. 2012年度，21~25号样本总RNA有降解；C. 2013年度，41~43号样本总RNA有降解；D. 2014年度，61~62号样本总RNA有降解；E. 2015年度，样本总RNA完整性均较好，无降解。
3. 实时定量（RT）-PCR检测不同储存时间脑肿瘤样本组织中管家基因GAPDH和ACTB mRNA的表达水平：结果显示，GAPDH和ACTB扩增曲线良好（图2A，B）；2个基因的溶解曲线均只有一个峰，说明实时定量PCR反应的特异性较高（图2C，D）。如图2E，F所示：2011年度样本扩增GAPDH和ACTB基因的Ct值均＞20，明显高于2012年度至2015年度样本的平均Ct值（P＜0.01），进一步表明样本中RNA的降解。2012年度至2015年度样本扩增GAPDH和ACTB基因的阈值循环数（Ct值）均在15～18，2个内参基因的表达量均较高，表明RNA保存完整，没有降解。2012年度样本扩增GAPDH和ACTB基因的Ct值高于2013年度至2015年度样本（P＜0.05），说明储存时间在3～4年的样本中，GAPDH和ACTB基因的表达量低于储存3年以内的样本，表明储存3年以内的样本所提取的总RNA质量更好，对于后续RNA水平的实验研究结果更准确。
图2. 实时定量PCR检测下不同储存时间脑肿瘤组织样本中管家基因GAPDH和ACTB mRNA的表达。A,B. GAPDH和ACTB基因扩增曲线例图；C,D. GAPDH和ACTB PCB产物溶解曲线例图；E,F. 2011年度至2015年度样本，GAPDH和ACTB mRNA实时定量PCR反应的Ct值。
讨论
收集足够数量的肿瘤样本是成功开展肿瘤实验研究的基本条件之一，建立肿瘤样本库，对于开展肿瘤相关的研究具有重要的医学意义[6]。临床和基础科研人员将利用其资源开展分子生物学、细胞生物学、遗传学、转录组学、基因组学及蛋白组学等新技术研究，探讨新的肿瘤分类、诊断、治疗和预后标准，开发肿瘤早期检测的实验技术和新型的治疗策略。目前，建立肿瘤标本库已经受到国内外肿瘤研究机构的广泛重视[7-9]。
首都医科大学附属北京天坛医院依托神经外科的学科优势，建立了标准、规范的脑肿瘤生物样本库，并对其进行信息化管理和质量控制。样本库的建立严格按照规范进行，从样本的取材至样本的储存，这一过程中的每一个步骤均有标准化的规定，并对样本的质量严格控制，以保证样本在采集及储存期间能够保持其生物学稳定性，可用于进一步实验研究。样本收集、入库、保存工作由专人负责，保证在组织样本离体后，30min内切成小块、液氮速冻、分装、放入手术室液氮罐暂存，当天转入样本库液氮罐中长期保存。其中，生物样本的收集过程是影响RNA质量重要的步骤，严格按照标准操作规范收集的标本，能够保证RNA质量，并延长样本RNA的储存年限[5]。同时，样本在取材、冻存和后续实验过程中，尽量避免基因组DNA、RNA和蛋白的降解[10-11]。
RNA样本的质量检测包括浓度、纯度、完整性以及RT-PCR反应扩增率。RNA浓度可以通过微量分光光度计测定260nm处的吸光度（A260）进行计算，纯度可以通过测定A260/A230和A260/A280的比值评估。A260/A230的比值应当≥2，如比值＜2，则表明存在盐离子或有机溶剂等污染；A260/A280的比值应为1.8～2.2，如果比值＜1.8，则表明存在蛋白质污染，同时，比值＞2.2，还表明RNA可能有降解[12]。RNA完整性检测可以通过RNA非变性电泳观察有无基因组DNA污染以及有无RNA降解[13]。实时定量PCR反应中，每个样本中基因扩增的Ct值与基因的起始拷贝数存在负相关的关系[14]，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此，只要比较不同样本的Ct值，即可计算出样本中含有特定基因的起始拷贝数的多少。GAPDH和ACTB是管家基因，在不同来源的细胞中的表达比较稳定，因此，可以通过比较RNA样本中GAPDH和ACTB基因扩增的Ct值，来判断样本中的可扩增片段的浓度。
基于上述指标，本研究对样本库2011年度至2015年度收集的100例脑肿瘤样本，使用Trizol试剂抽提总RNA，考察不同保存年限的组织样本提取的RNA质量。结果表明，样本使用前需进行RNA的质量检测，保存时间在4年以内的样本，所提取的RNA纯度、完整性较好，能有效扩增内参基因，符合RNA质量评价要求，可以进行进一步的RNA水平实验研究，比如RNA表达水平分析、表达谱芯片分析和RNA测序等。肿瘤组织样本RNA在储存期间仍可能存在缓慢降解，因此，建议每年定期抽查样本RNA质量，按不同收集年度，随机抽取1%～2%的样本，RNA未降解为合格标本。同时，做好出库前的质量评价，RNA有严重降解的标本则不再出库使用。
建立脑肿瘤生物样本库对开展肿瘤的相关研究具有重要意义，近年来已引起广泛重视，多地神经外科中心已经建立或正在筹划之中。但规范化高质量的生物样本库涉及到样本采集、处理、入库、储存、信息化管理和质量控制等多个环节，任何环节的疏漏都会影响样本的质量。首都医科大学附属北京天坛医院神经外科于2010年11月率先建立了规范化的样本库，并对5年来的样本RNA质量（包括浓度、纯度、完整性、反转录反应和管家基因）进行检测。结果表明，储存时间在4年以内的样本RNA纯度和完整性较好，能有效扩增内参基因，可以进行进一步的RNA水平研究。这是颇有意义的一项工作，对规范化的脑肿瘤生物样本库的建立定会起到积极的指导作用。
解放军总医院神经外科 周定标
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