组织芯片技术研究FSCN 1蛋白在垂体腺瘤中的表达及意义|【中华神外】2016年第五期“颅内肿瘤”
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今天刊登的是王红云、刘春晖、张亚卓、高华等在《中华神经外科杂志》2016年第五期上发表的《组织芯片技术研究FSCN 1蛋白在垂体腺瘤中的表达及意义》，欢迎阅读。
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垂体腺瘤是颅内第二大肿瘤，流行病学资料显示垂体腺瘤约占颅内肿瘤的10％～15％[1]。Jefferson最早提出侵袭性垂体腺瘤（invasive pituitary adenoma，IPA）的概念，认为这部分肿瘤介于良、恶性之间，肿瘤呈侵袭性生长。IPA约占垂体腺瘤总数的1/3，治愈率较低、致残率较高，总体复发率超过30％。2007年世界卫生组织对侵袭的分类建议主要是侵犯周围组织和有丝分裂指数升高（Ki-67≥3％）[2]，其他常用指标如p53、Galectin-3、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶、基质金属蛋白酶-9等仍存在一定争议善[3-6]。
FSCN1又称Fascin-1蛋白，是一种相对分子质量为55000的细胞骨架蛋白，包含4个串联的FSCN结构域，将F-肌动蛋白结合连接成有序、平行的微丝束[7]。通过促进细胞膜丝状伪足、片状伪足和微棘的形成，从而改变细胞骨架的结构，提高细胞运动能力，促使细胞产生各种恶性行为，引起肿瘤的发生发展[8]。FSCN1在多数正常上皮细胞中呈低表达或不表达，在许多上皮来源性肿瘤中如胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、肾细胞癌、膀胱癌、神经胶质瘤等呈高表达[9-11]。免疫组化研究发现，在多个肿瘤类型中，FSCN1水平跟肿瘤预后密切相关。在结肠癌中，FSCN1作为β-Catenin-TCF信号通路的靶基因参与肿瘤细胞的迁移[12]。
组织芯片技术使大规模分子病理检测成为可能，具有节约样本和降低组间差异和组内差异的特点。本研究采用组织芯片技术构建包含10例正常垂体组织、97例侵袭性垂体腺瘤和115例非侵袭性垂体腺瘤石蜡包埋标本，利用LeicaBOND-Ⅲ系统检测FSCN1蛋白的表达情况，分析FSCN1蛋白与垂体腺瘤的关系。
材料与方法
1. 一般资料：根据世界卫生组织2007年垂体腺瘤组织学分类，标本来自北京市神经外科研究所垂体腺瘤生物样本库，经首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会同意（批准文号：KY2013-015-02），自2008年5月至2013年7月随访资料完整的垂体腺瘤212例，其中侵袭组97例，非侵袭组115例。侵袭性诊断标准采用：（1）Knosp分级Ⅲ～Ⅳ级和Hardy分级Ⅲ～Ⅳ级；（2）经病理证实为肿瘤细胞侵犯骨质或邻近硬脑膜；（3）肿瘤细胞侵入蝶窦腔或周围血管和神经。212例患者中，男90例，女122例；肿瘤最大径为1.1～7.1cm，随访证实复发26例。10例正常垂体组织来自遗体捐献，均签署知情同意书。
2. 组织芯片构建：设计6×6点列阵的组织芯片受体模块，选择目标组织并分别在组织切片和相应石蜡组织上标记，每个样品随机取3处，用取材针从已定位的石蜡上取目标组织（直径2mm）到组织芯片受体蜡块的相应孔内，制作成组织阵列蜡块。
3. 免疫组化检测：将蜡块连续切片，切片厚度为4μm，将切片脱蜡和梯度酒精水化，按Leica公司推荐的全自动染色流程使用乳腺癌组织作为阳性组织进行试染色，通过多轮次对修复条件、抗体浓度和分化时间进行调整和优化：碱修复20min，FSCN1（1：500）15min 。图像采集使用Leica一体化采集系统（APERIO AT2）。定义：阴性为阳性表达细胞数＜10％，阳性为阳性表达细胞数≥10％；低表达为阳性表达细胞数＜50％，高表达为阳性表达细胞数≥50％。
4. 免疫印迹实验：采用BCA法检测蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂牛奶封闭1h，分别加入FSCN1 （1∶1000）、β-actin（1∶5000），4℃过夜。TBST洗膜3次，加入相应二抗，室温孵育1h，洗膜同前。加入化学发光液，于Amersh am Imager600（GE）检测条带，分析灰度值，用FSCN1/β-actin的比值表示FSCN1的表达水平。
5. 统计学方法：采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。实验结果`X+s表示，采用χ2检验用于FSCN1表达水平与临床病理特征关系的检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1. 免疫组化实验结果（图1）：在标本中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性染色。结果显示，在正常垂体的9例基底样细胞呈FSCN1阴性表达，1例阳性，其阳性比例为1／10；在垂体腺瘤的基底样细胞中FSCN1呈强阳性，而侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤之间差异有统计学意义。其中侵袭组FSCN1核阳性率为54.6％（53/97 ），非侵袭组FSCN1核阳性率为18.3％（21/ 115）（χ2＝30.65，P＝0.004）；侵袭组FSCN1胞质阳性率为37.1％（36/97），非侵袭组FSCN1胞质阳性率为6.9％（8/115）（χ2＝29.09，P＝0.000）。
图1. 免疫组化染色显示FSCN1在正常垂体和各组垂体腺瘤中的表现水平。A，D. 正常垂体：细胞排列整齐，腺样结构较多，核规则，偶见阳性细胞；B，E. 非侵袭组：细胞排列整齐，腺样结构少，染色质深染，散在阳性细胞；C，F. 侵袭组：细胞排列不规则，可见核异型，染色质浓缩，可见大量染色阳性的基底样细胞（A-C：免疫组化染色x40；D-F：免疫组化染色x400）
2. 免疫印迹实验结果（图2）：与正常垂体的FSCN1表达水平相比，垂体腺瘤呈高表达。侵袭组FSCN1的蛋白水平是非侵袭组的1.78倍，超过正常垂体的5倍。
图2. 免疫印迹试验检测FSCN1在不同组垂体瘤的表达水平。A. 免疫印迹试验，上样顺序：1~2为正常垂体；3~5为非侵袭组；6~8为侵袭组；B. 统计结果显示FSCN1在垂体腺瘤中均高于正常垂体，侵袭组最高，超过正常垂体的5倍（a与正常组相比；b与非侵袭组相比）。
3. FSCN1水平同临床资料和预后的关系（表1）：在男性中FSCN1的高表达率高于女性，差异有统计学意义（χ2＝3.942，P＝0.047 ）；在不同肿瘤体积之间比较差异有统计学意义，大腺瘤的FACN1高表达比例更高（χ2＝17.11，P＝0.000），与年龄无关（χ2＝0.405，P＝0.524）。所有212例患者均获得临床随访，随访时间为2～6年，平均3.1年。在67例FSCN1高表达组中，肿瘤复发率为22.4％（15/67），在145例低表达组中，肿瘤复发率为7.6％（11/145）（χ2＝9．3310，P＝0.002），差异有统计学意义。
表1. 2012例垂体腺瘤标本中FSCN1表达与临床资料的相关性。
讨论
由于组织芯片技术具有高通量、实验条件一致性、实验结果可比性好及实验误差小等优点，在病理学研究中有广阔的应用前景，近年来其在肿瘤分子病理学等研究领域的应用越来越多[13]。本研究构建包含正常垂体和垂体腺瘤的组织芯片，高通量筛查FSCN1在垂体腺瘤中的表达水平，发现FSCN1的表达跟肿瘤体积和复发密切相关。
FSCN1为进化保守的一种细胞内蛋白，其主要功能是与F-肌动蛋白结合，并将其组装成平行排列的肌动蛋白束[14]。在乳腺癌、结肠癌、食管癌和胃癌中，FSCN1增加了肿瘤远处转移、预后不良的风险[11]。根据免疫组化结果的Meta分析显示，FSCN1是一种新的早期识别侵袭性和转移性肿瘤的潜在的生物标志物。目前，针对FSCN1促进肿瘤细胞侵袭的可能机制研究较多，具体包括以下几方面：（1）通过影响肿瘤细胞形态的改变，特别是微突出以及丝状伪足的形成；（2）侵袭性的指样突出是细胞侵袭和降解细胞外基质的一个重要结构；（3）影响基质金属蛋白酶的活性；（4）抑制非编码小RNA在肿瘤组织中的表达[15]。
在许多上皮来源性肿瘤（如胃癌、鼻咽癌等）中，FSCN1基因呈高表达，且其表达水平与肿瘤细胞的侵袭转移能力和预后密切相关[16]。虽然垂体腺瘤多数为良性肿瘤，但因其生长部位毗邻许多重要器官和组织，且可以表现为侵袭性生长，侵袭性垂体腺瘤预后较差。本研究结果表明，垂体腺瘤FSCN1核阳性率为34.9％ （74/212），胞质阳性率为20.8％（44/212） 。按是否侵袭分类，核阳性率分别为54.6％ （53/97）和18.3％（21/115），胞质阳性率分别为37.1％（36/97）和6.9％（8/115）。本研究推测FSCN1从胞核向胞质转位后调节肿瘤细胞的侵袭能力，胞质内的FSCN1是其活性形式。
总之，本研究采用组织芯片技术与免疫组化技术相结合，提高了实验结果的可信度，FSCN1水平跟垂体腺瘤细胞的侵袭能力呈正相关，有望成为衡量垂体腺瘤侵袭能力的分子标志物，并用于临床检测。
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