丙戊酸对SAH早期受损伤脑组织的保护作用
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【Ref: Ying GY, et al. Neurosurgery. 2016 Aug;79(2):286-95.】
蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）占所有脑卒中的5%-10%，大多由颅内动脉瘤破裂所致。不少研究指出早期脑损伤（early brain injury，EBI）是SAH后患者致残致死的重要原因。血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的破坏和神经细胞凋亡是EBI过程中主要的病理变化；热休克蛋白（heat shock protein，HSPs）和基质金属酶（matrix metalloproteinases，MMPs）介导的信号通路是决定脑出血性疾病转归的重要角色。既往研究表明，HSP70通过NF-κB降低MMP-9的活性，从而保护血脑屏障的细胞外基质免受破坏；此外，通过Akt起到抗凋亡的作用。近年来发现，一线抗癫痫药物--丙戊酸（valproic acid，VPA）在脑血管病中有保护神经的功效。浙江大学医学院附属第二医院神经外科的Guang-yu Ying等撰文介绍在陈高教授主持下，经建立大鼠SAH模型，研究VPA通过HSP70/MMP-9和HSP70/Akt信号通路，在SAH后的EBI中发挥保护神经的作用，结果发表在2016年8月的《Neurosurgery》杂志上。
研究者采用单纤维尼龙缝线穿刺颈内动脉制作大鼠SAH模型。实验主要由两部分组成，实验一，将128只大鼠分为3组：假手术（sham）组30只，SAH+溶剂组51只和SAH+VPA组47只；实验二，将103只大鼠分为3组：SAH+溶剂组36只，SAH+VPA组33只，SAH+VPA+槲皮素组34只。从以下几个方面评估EBI程度和相关信号通路状况：①采用改良Garcia评分系统评估神经系统功能，使用SAH分级评分评估脑损伤程度；②测量脑水分含量评估脑水肿；③测量Evans蓝渗出量评估BBB破坏情况；④明胶酶谱分析MMP活性；⑤TUNEL染色试验分析细胞凋亡情况；⑥电镜下观察的皮层神经元的凋亡情况；⑦免疫荧光和Western blot分析MMP-9、HSP70、p-Akt/Akt、Bcl-2、紧密连接蛋白occludin和claudin-5的表达或分布情况。
实验结果如下：SAH大鼠模型中，溶剂处理与VPA处理后SAH分级评分相似，前者的死亡率41.2%高于后者的36.1%，但是无显著性差异。VPA处理后Evans蓝的渗出量、脑水分含量显著降低，神经系统功能明显改善（图1）。
图1. Sham组、SAH+溶剂组、SAH+VPA组动物SAH后24小时SAH分级评分（A）、Evans蓝渗出（B）、脑水分含量（C）和Garcia评分（D）情况对比。
免疫组化染色发现，MMP-9与神经细胞核（neuronal nuclei，NeuN）以及RECA-1有共同定位特征，提示MMP-9主要分布在神经细胞和内皮细胞中（图2）。Western blot结果显示，SAH可导致MMP-9蛋白表达水平升高，而紧密连接蛋白occludin和claudin-5表达水平降低；在VPA处理后MMP-9的表达受到显著抑制，被降解的紧密连接蛋白水平得到恢复（图3）。明胶酶谱试验发现，MMP-9的活性表现呈同样变化（图4）。
图2. SAH后24小时取实验动物的同侧皮质，进行免疫荧光双标染色显示的MMP-9/NeuN（A-C）、MMP-9/GFAP（D-F）、MMP-9/RECA-1（G-I）的情况。
图3. SAH后24小时，取实验动物脑组织测定各组MMP-9（A、C）、occludin（A、B）和claudin-5（A、D）的表达情况。
图4. SAH后24小时取实验动物大脑行明胶酶谱试验发现，与溶剂组相比，VPA处理可降低MMP-9（A、B）的活性，但是对MMP-2（A、C）的活性没有影响。
TUNEL染色发现，SAH后24小时神经细胞的凋亡水平显著升高，而VPA可明显降低细胞凋亡率。电镜观察表明，SAH后神经细胞核、染色质聚缩，符合凋亡的早期阶段表现，而VPA可减少这类异常神经细胞的数量（图7）。进一步测定凋亡蛋白和切割caspase-3蛋白的表达水平，得到同样的变化结果（图5）。探究凋亡信号上游通路蛋白的表达，发现SAH显著促进HSP70的表达，同时明显抑制p-Akt和bcl-2的表达；与溶剂处理相比，VPA导致上述蛋白水平的显著提高（图6）。
图5. VPA处理对SAH大鼠皮质细胞凋亡（A、B）水平和剪切caspase-3（C、D）蛋白表达水平的影响。
图6. SAH后24小时，VPA处理组可见HSP70（A、B）、p-Akt（A、C）和Bcl-2（A、D）蛋白表达水平显著增高。
图7. 电镜下可见SAH后皮质神经细胞的变化。溶剂处理后细胞皱缩，细胞核、染色质固缩，聚集在核周，细胞处于凋亡早期（A）；VPA处理后对处于凋亡的细胞起到保护作用（B）。
为证实VPA的神经保护作用是否是通过HSP70介导，在VPA的基础上加用HSP70抑制剂--槲皮素，结果发现槲皮素显著抑制VPA诱导的HSP70表达水平，加重脑水肿、BBB的破坏程度和细胞凋亡（图8）。
图8. 槲皮素处理后，显著抑制VPA对脑水肿（A）、BBB（B）和凋亡细胞（C、D）的保护作用，HSP70蛋白表达受到抑制（E、F）。
该研究在大鼠SAH动物模型中证实，VPA治疗可以阻止SAH后的BBB破坏、脑水肿和细胞凋亡的进展，以及改善神经系统功能。VPA的作用机制可能是HSP70/MMP9和HSP70/Akt信号通路的介导。
（浙江大学附属第二医院王勇杰编译，《神外资讯》主编、复旦大学附属华山医院陈衔城教授审校）
陈高，浙江大学教授、博士生导师，浙江大学医学院附属第二医院神经外科科室常务副主任、主任医师。中华医学会神经外科分会全国委员、中国医师协会神经外科专业委员会委员、中国中西医结合学会神经外科分会副主任委员、浙江省中西医结合学会神经外科专业委员会主任委员、浙江省医学会神经外科分会副主任委员、浙江省神经外科技术指导中心副主任。带领的团队担负着浙江省神经外科疾病诊治的主要任务，科室年手术量>7000台。长期致力于神经外科疾病的临床及基础研究，研究成果在国内外处于前沿水平，团队成员来自Michigan大学、Loma Linda大学等世界著名脑血管病研究中心，累计培养博士与硕士研究生50余人。主持多项国家自然科学基金、国家科技支撑计划、浙江省重大科技专项等课题。近3年作为通讯作者发表影响因子大于5分的SCI论文11篇。先后出版与编译《实用颅底显微外科》、《颅内动脉瘤手术视频图谱》等专著。作为主要完成人先后荣获中华医学会科技进步二等奖、浙江省科技进步一等奖。
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