除了NGS，你还应该知道这4种技术| Nature综述解读（下）
哈喽，分别的时光果然特别漫长，科技君竟有点迫不及待想要见到大家！昨天的Nature综述解读，我们一起回顾了NGS技术发展史，重点展示了包括华大基因在内的4家公司带来的突破性测序产品，并且分析了短读长测序的原理特点。错过了的小伙伴，请戳这里搭乘时光机：NGS十年发展史，看这篇就够了 | Nature综述解读（上）
今天的文章又会有哪些亮点呢？事不宜迟，让我们一起继续Nature综述解读之旅吧！
三、长序列读取技术
读长短一直是二代测序的软肋，对于高度杂合的基因组、高度重复序列、高GC的区域、拷贝数变异、大的结构变异等问题，二代测序都解决不了。读长长也有利于转录组的研究，可以直接获得全长转录组。
目前市场上出现的长读长技术主要有两类：一是单分子实时测序技术，主要有两家公司：Pacific BioScience和Oxford Nanopore；二是标记大片段，通过短读长数据拼接形成大片段，CG公司早在2012年就发表了这个技术，但后续推出商业化试剂盒的是Illumina和10X Genomics。
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单分子长片段测序
2013年英国Oxford Nanopore Technologies公司宣布将启动MinION测序仪的试用计划，参与者只需支付1000美元的押金以及运费，就可以收到一台MinION测序仪，包括测序USB装置、流动槽和软件。测序仪很小，是真正的掌上测序仪。但两年多了，市面上还没有看到这个测序仪的大规模使用，可能在性能方面没有达到预期。
目前开发者利用该测序仪体积小、建库快、实时产生数据等特点获得资本投资。2014年埃博拉病毒爆发，MinION测序仪以最快的速度破译病毒序列，这可能是目前为止它最突出的应用，希望未来会有新的突破。
图1.Oxford Nanopore Technologies公司的MinION测序仪
目前比较受市场热捧的三代测序是PacBio的RSⅡ（测序原理见图2）。该测序技术不需要对目标DNA进行PCR扩增，而是直接在目标片段两端加上两个发卡结构的接头，形成一个连续的环状。单个DNA片段分布到Pacific Biosciences公司发明的一种直径只有几十纳米的纳米孔【zero-mode waveguides (ZMWs)】，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。A、T、C、G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入孔内又出去，当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成、荧光基团被DNA聚合酶切除为止。共聚焦显微镜实时、快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录。
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人工合成长片段测序
另外一种长片段测序技术就是先把大片段DNA（＞10Kb）用接头标记，然后建小片段文库得到短序列，根据接头信息拼接还原大片段（原理见图3）。
Illumina采用384孔板对大片段进行物理分离，使得每个孔里尽量只有一条DNA片段，每个孔分别标记，单独建小片段文库，最后所有文库混合形成一个文库，在HiSeq测序平台上测序。
10X Genomics则采用了乳液PCR的方法在单管里面操作，大片段DNA与凝胶珠子、引物、酶、dNTP等分布在一个个油滴里面，形成一种物理分隔。每个油滴里面有一种标签，形成一个小片段文库，最后加热使凝胶溶解、解除油滴封闭，混合产物在HiSeq测序平台上测序。这个平台的好处是采用了14个碱基的标签，油包水的方法可以使标签使用率最大化，且减少耗材和人工操作，更加利于推广。
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单分子实时测序VS合成大片段测序
表1.SMRT与合成大片段各有优劣
四、与NGS存在竞争或互补关系的技术
测序不是万能的，不能解决所有问题。除了NGS之外，下面这4种技术各有优点，可以弥补它的不足之处。
1. DNA芯片
基因芯片早在上世纪80年代就在生命科学领域应用了。利用碱基互补原理，以单链DNA（ssDNA）作为探针，与目标DNA杂交，检测荧光信号来确定目标分子的强度（见图4中的a项）。应用很广泛，SNP分型芯片可以用于疾病筛查（如心血管疾病、癌症、病原菌）和GWAS分析；低分辨度的芯片还可以做结构变异、拷贝数变异、蛋白与DNA互作研究。表达谱芯片可以检测已知基因的表达量。
因芯片具有可重复性高、价格低、操作简单等特性，目前在基因组研究中应用广泛。表达谱芯片有可能被RNA-seq取代。
2.NanoString
美国NanoString 是继生物芯片技术和新一代测序技术（NGS)后，在基因表达谱分析上展示出强大应用前景的新技术公司。nCounter Analysis System是直接对基因表达进行多重计数的全新数字式技术，利用分子条形码和单分子成像来检测及统计每一个反应体系中特定转录本的数量，表现出极高的灵敏度、精确度和重复性。该技术上无需使用酶，无需反转录，也不需要做PCR 扩增，可进一步减少误差的产生，因此nCounter 在表达谱定量分析领域具有无可比拟的优势。
3.qPCR
实时荧光qPCR早在上世纪90年代就在临床和科研领域广泛推崇使用了。因它具有高灵敏性和特异性，被美国FDA承认并推崇，是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术。
4.Optical Mapping
Optical Mapping技术是基于限制性内切酶图谱的技术，可以称之为光学化或数字化酶切指纹图谱技术。将DNA固定在界面上，在界面表面进行酶切反应，然后将DNA进行荧光染色，并在显微镜下观测。每条DNA被酶切后的片段大小及顺序形成单分子限制性酶切指纹。软件利用酶切指纹组装成最终的指纹图谱。
该技术主要是用来辅助基因组序列组装：辅助延伸scaffold，使基因组图谱更精细；发现染色体的倒置、插入、缺失和置换；识别并纠正错误组装序列；检测gap大小及位置。
美国BioNano 公司开发的Irys系统在它的基础上进行改进，只是在DNA单链上切口（不切断），加入荧光基团，然后让整条DNA链通过纳米通道。他们的理想是最终真实展现染色体的情况，最新研发结果是可以让酵母12M的染色体完整展现。
五、结语
虽然目前测序技术处于快速发展的阶段，新技术层出不穷，周期不断压缩、成本逐年下降，使得临床医生可以把基因组数据转化成具有临床指导意义的结果。但我们还面临新的挑战，如果想在临床上进一步扩大应用，那么时间是一个问题。因为目前测序技术从样品准备到数据分析完成还是需要几周的时间，但是对于恶性肿瘤的诊断和一些疑难杂症的诊断，可能只有几天的时间。
另一个挑战就是数据存储和数据分析。2013年有研究者推测，全球每年会新增15PB的数据。这么庞大的数据需要有创新性的存储系统和生物信息分析解决方法。
此外，消费者会对遗传检测结果作何反应？假阴性和假阳性结果对患者会带来什么影响？这些基因组数据的使用效果和伦理问题，是每一个业内人士都需要思考的。
好啦，文章到此全部结束，一起和科技君做个小调查吧！
参考文献：
Sara Goodwin, John D. McPherson, W. Richard McCombie. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature,17 (2016),333-351
撰稿：徐晓玲
编辑：市场部
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