省钱省时！小样本重测序发文的诀窍在哪里？ | 发文36计

几个样本，只是做重测序没办法发好文章？科技君原以为想要挖掘和表型相关的基因需要群体，个体重测序只能检测变异信息，没有办法深度挖掘生物学故事。但是看了下面的内容，科技君认为这也没有什么不可能。

全文约2200字，建议阅读5分钟。

千姿百态的大自然由丰富多彩的动植物和其他生物共同组建，他们表型的多样性来源于丰富的遗传变异信息。动植物主要的遗传变异包括单碱基变异（SNP）、插入缺失（InDel）、结构变异（SV）、拷贝数变异（CNV）等，就是这些不同类型变异的存在，使得动植物间出现了颜色差异、抗病性差异、品质差异、和其他各种农艺性状差异。变异信息是我们进一步研究动植物表型差异的基础，它们可以作为分子标记帮助研究人员挖掘和选育优良的种质资源。

随着测序技术的发展，动植物变异检测有多种技术手段可以选择，现在我们可以根据具体需求选择最适宜的技术手段。

表1.动植物变异检测技术比较

不同的技术手段适用于不同的群体类型和研究目的，总的来说基于不同分型手段的研究方向如下所示，但大部分的研究方向都需要有对应的群体，如自然群体、家系群体、突变体等。

那么如果只是几个样本测序，不属于特定的群体类型但又想要深度挖掘生物学故事就无解了吗？当然不是，我们有充足的证据证明这种言论是错误的。利用高通量测序检测变异信息可以继续进行进化、功能基因挖掘等研究。针对少量个体的重测序，也是有多种研究策略的，下面我们来一看究竟：

1.优良性状个体测序，与大量的已知数据库信息比较，筛选独特位点

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Lyu J, Zhang S, Dong Y, et al. Analysis of elite variety tag SNPs reveals an important allele in upland rice[J]. Nature communications, 2013, 4. （华大参与）

经过长期人工选育的具独特性状的作物优良品种，很可能固定了一些在祖先基因库中以低频状态存在的优质等位基因(elite allele)。这些优质等位基因贡献了该优良品种的优良农艺性状。在传统的遗传学研究中，科学家使用数量性状位点连锁作图（Quantitative trait loci linkage mapping）或关联作图（Association mapping）的方法定位农艺性状相关基因。但是，连锁作图需要耗费长时间构建分离群体，而关联作图对于群体中以低频状态存在的等位基因定位功效低。

为了高效快速地鉴定优质品系中的优质等位基因，新的鉴定方法——改良品系标签位点分析（Elite variety tag SNP analysis, ETAS analysis）被提出。本文选择6个优良的水稻品系与2个大的control样本数据进行比较，检测改良品系标签位点(ETASs)。

材料选择

●优良品种：6个优良的水稻品种
Guichao2：indica，产量高；
Minghui63：indica, 雄性不育恢复系，抗稻瘟病；
IR64：indica，广泛的适应性和产量高；
IRAT104：japonica, 抗旱；
Koshihikari：japonica, 香味；
Chujing27：japonica， 产量高，广泛的适应性；

●已发布的数据包括control I (40个栽培种主要是地方种，25个野生种)，control II（517个中国地方种）。

技术应用

●全基因组重测序每个测序~15X。

分析结果 

●使用ETAS 分析，在著名的水稻改良品种，如高产的Guichao2、抗旱的IRAT104中，鉴定出与这些改良品种对应的标签位点；

●进一步对陆稻IRAT104中的一个标签位点深入分析发现，此位点在陆稻与水稻中具有很大的频率差异（61% vs 3%），且其附近具有显著的人工选择信号；功能分析表明，此位点落在脱落酸合成的限速酶NCED基因的编码区；

●通过个体基因组与群体基因组的比较，可以为鉴定改良基因提供重要依据。

2.进化研究

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Mei C, Wang H, Zhu W, et al. Whole-genome sequencing of the endangered bovine species Gayal (Bos frontalis) provides new insights into its genetic features[J]. Scientific reports, 2016, 6.（华大参与）

大额牛（Gayal）是半野生濒临灭绝的牛品种，多种表型有别于家牛，而且其遗传背景未知。它的染色体条数（2n = 58）与家牛（Bos indicus和Bos taurus 染色体条数2n = 60）和印度野牛（Bos Gaurus染色体条数2n = 56）都不同。之前有报道称大额牛与家牛可以杂交，雌性后代可育，但是雄性后代不一定可育。大额牛经过自然选择但是未经过人工选择，还保留了它特有的性状。本文通过全基因组重测序深度解析大额牛的遗传特性。

材料选择

●大额牛Gayal（半野生），红安格斯牛RAN和日本黑牛JBC作为对照。

技术应用

●全基因组重测序平均11.78X。

分析结果

●Gayal检测到的SNP有62.24%是其特有的，其中16,901个品种特异性非同义SNP与Gayal的一些性状关联；

●利用PSMC分析发现牛的进化历史上有2次扩张和2次瓶颈效应；

●结合原有已发表数据进行进化分析发现Gayal是雄性野牛和雌性家牛的杂交后代。

3.抗性诊断标记开发

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Yang H, Jian J, Li X, et al. Application of whole genome re-sequencing data in the development of diagnostic DNA markers tightly linked to a disease-resistance locus for marker-assisted selection in lupin (Lupinus angustifolius)[J]. BMC genomics, 2015, 16(1): 1.

随着分子育种的发展，标记辅助选择已经成功用于商业品种的选育。但在育种过程中发现还有很大一部分的标记辅助选择（MAS）、QTL、分子标记的育种效果并未发挥作用。MAS需要标记与目标性状相关基因紧密连锁最好是共分离，另外标记需要具有广适性即该标记能用于大范围的种质筛选中。同时满足这两点需求的标记比较难获得。传统方法检测功能性标记和诊断标记耗时都比较长。

高通量测序可以用于开发高密度的分子标记，同时还可以帮助快速挖掘诊断标记。抗茎枯病是羽扇豆育种的主要发展方向之一，之前研究发现至少有Phr1、Phr1 和PhtjR三个主要的基因在澳大利亚驯化羽扇豆中发挥作用，但是没有挖掘到能够成功用于MAS的PhtjR共分离的标记。本文利用全基因组重测序方法快速检测到了多个候选的诊断标记。

材料选择

●9个羽扇豆栽培种：Unicrop、Yorrel 、Merrit、 Kalya 、Tallerack、 Quilinock 、Mandelup、 Coromup、 Jenabillup，参考基因组序列为Tanjil且携带有PhtjR基因；

●Tanjil 和Unicrop构建的F8群体，之前已构建过遗传图谱。

技术应用

●每个栽培种全基因组重测序9-15X。

分析结果

●测序数据与参考基因组比对检测到180,596-795,735个SNP和33,094 -122,513个InDels；

●共207,887 标记锚定到羽扇豆遗传连锁图谱上，其中387 个SNP和87个InDel与一些重要的农艺性状相关的11个基因连锁；

●利用作图群体定位结果和重测序数据检测到17个候选诊断标记与抗茎枯病基因PhtjR连锁，选择10个标记（5个诊断标记、5个非诊断标记）验证了5个诊断标记的有效性；

●连锁分析定位到与PhtjR基因连锁最紧密的3个基因位于一个scaffold上，利用重测序数据在这个scaffold上检测到489个SNP标记和101个InDel标记，其中有187个SNP和56个InDel标记在所有10个样品中与PhtjR基因表型关联，也可以认为是诊断标记。选择6个SNP和4个InDel经验证3个SNP和2个InDel为诊断标记。

下面，我们来划一下重点（敲黑板）！——个体重测序进行上述研究需要哪些条件？

前提是，您首先要有明确的研究目标，然后才是清晰的研究步骤。

1.找到个体重测序的样本。
——这真的不是一句废话。

2.进行深度高一些的全基因组重测序。
——高深度测序保证基因组覆盖度和变异检测的准确性。

3.针对本物种遗传背景的知识储备。
——特别重要。不过可能需要对该物种更了解的您来主导。

4.大量的本物种的、已知的、可获得的基因组数据。
——非常重要。个体重测序需要大量本物种的数据辅助过滤，以找到测序样本特有信息。

5.确定研究要点进行信息分析。
——需要强强联合。科技君内举不避亲，自信推荐华大团队，毕竟上面的前两篇文章华大都有参与，经验值还是很厉害的！

撰文：小   萍

编辑：市场部

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