【文章解读】系统的ctDNA分析揭示早期肺癌的进化

本研究利用肿瘤特异性的系统进化途径分析了TRACERx病人的ctDNA。研究鉴定了ctDNA释放的独立预测因子，并分析肿瘤体积的检测限制。通过对术后血浆的盲分析，观察到了辅助化疗的耐受性，并能确定出可能复发的肺癌病人。该项研究对ctDNA的系统进化分析跟踪了肺癌转移和复发的亚克隆性质，为ctDNA相关的治疗研究提供了新方法。

文章题目：Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution

研究人员：多家机构联盟研究（eg.Cancer Research UK Lung Cancer Centre of Excellence London and Manchester, University College London Cancer Institute）

发表时间：2017.05.26

期刊名称：Nature

影响因子：40.137

研究背景

肺癌的致死率居所有癌症的首位。目前转移的非小细胞肺癌不能通过系统的化疗治愈，临床研究表明，只有5%的患者能够在术后的辅助化疗中获益。获益的患者可能是由于手术残留比较小体积的肿瘤组织，使得肿瘤内部的异质性降到了最低。

基于ctDNA监测的液体活检技术与早期肺癌复发转移之间的关系还没有建立。类似的研究在乳腺癌和结直肠癌中已经开展，研究表明术后ctDNA跟踪能够早于临床发现复发，从而在早期为病人提供新的治疗方法。

研究概览

研究手段：

• 100 例TRACERx (Tracking Non-Small-Cell Lung Cancer Evolution Through Therapy (Rx))（其中有一例病人：从一开始患病到尸检各个阶段取样）

• 肿瘤组织：M-seq exome

• ctDNA：multiplex-PCR next-generation sequencing （术前和术后多时间点取样）

研究内容:  

1. ctDNA释放的因素预测；

2. ctDNA早检的限制因素：肿瘤体积；

3. 发现联合化疗耐药的证据和易复发的人群特征；

4. ctDNA profiling 跟踪研究，揭示肺癌复发和转移的本质；

分析

1. ctDNA profiling

1.1    测序分析：

100例NSCLC： 肿瘤组织 : M-seq（exome）； ctDNA: multiplex-PCR NGS

每一个病人的肿瘤组织：M-seq(exome)建立进化树

每一个病人基于肿瘤组织的主克隆和亚克隆SNVs建立每个病人的multiplex-PCR assay panel，然后合并在一起，用于在液体活检中跟踪肿瘤的一个进化过程（见Figure1）。

1.2    血浆中检测SNV

SNVs突变频率>0.1% 时，灵敏度为99%以上

Call snv 阈值：突变数目>=2

   Figure 1. ctDNA跟踪研究过程

2. 在非小细胞肺癌血浆中检测到ctDNA的决定性因素

2.1    样品量和样品

96例NSCLC术前血液样品（4例没有通过质控或者缺少血液样品）

2.2    Individual assay panels设计：每个样品平均18个snvs（range，10-22），包括平均11个主克隆snvs（range，2-20）和平均6个亚克隆snvs（range，0-16）。

2.3    芯片panels结果

早期肺鳞癌患者中有48%（46/96）检测到至少两个SNVs，在外加组的12例样品中能够检测到一个SNV(见Figure2a)。

1. ctDNA的释放和肿瘤的组织亚型密切相关：97%的肺鳞癌和71%的其他类型的非小细胞肺癌亚型都是ctDNA呈阳性（>=2 个SNVs），相比之下肺腺癌只有19%呈ctDNA阳性。曾有报道被动的释放ctDNA到外周血中可能和细胞坏死有关。在本次研究中也确实如此，LUSC（肺鳞癌）的坏死程度明显高于LUAD（肺腺癌）。而在LUAD中ctDNA检测呈阳性的样品也是坏死程度比较高的一个亚型。

2.  预测ctDNA detection：细胞坏死，淋巴结入侵，淋巴血管侵犯，病理上肿瘤大小，Ki67标记指数，非腺癌组织和所有cfDNA分别用单因素分析来预测ctDNA detection的情况。多因素分析揭示非腺癌的组织学特征，淋巴血管侵犯和高的Ki67扩增指数可以作为非腺癌ctDNA detection的预测指标。

3. Driver events：在LUAD样品中KRAS, EGFR 或 TP53突变和ctDNA detection没有显著相关性。

Figure2 a. ctDNA检测的临床病理预测因子

2.4   主克隆和亚克隆突变在ctDNA检出阳性样品中的分布（见Figure 2b）

1. 主克隆（100%样品检出率）：46个ctDNA阳性的样品中均检测到主克隆突变，平均94%（11%-100%）的芯片panels位点被检出。

2. 亚克隆（68%样品检出率）：46个ctDNA阳性的样品中有40个是设计了亚克隆芯片panels的，其中有27（68%）个样品中能检测到亚克隆突变。在每一个ctDNA阳性样品中，平均有27%（0-91%）的亚克隆SNVs能被检出。

        结论：主克隆SNVs的平均突变频率比亚克隆的高，用主克隆突变作为ctDNA检出的方法比采用亚克隆突变的灵敏度高。

Figure2 b.在三种类型样品中主克隆和亚克隆的分布

2.5   在ctDNA阳性样品中，肿瘤体积的大小和克隆SNVs 等位基因突变频率（VAF）的关系

1. 46个ctDNA阳性样品中的38个选出来做CT检测，肿瘤的体积和血液中主克隆突变的VAF，数据经过log转换之后，呈线性相关（Spearman’s ρ = 0.61, P < 0.001,n = 38）（见Figure3a）。

   Figure 3.肿瘤体积预测血浆中VAF

2. 基于以上建立的线性模型，预测ctDNA检出肿瘤突变时，肿瘤的体积大小。例如肿瘤体积在10立方厘米，能够检出VAF为0.1%的克隆突变（见Figure3b）。如果说一立方厘米的纯肿瘤组织含有9.4x107 个细胞，检测血浆里VAF为0.1%的突变大概要有326百万个肿瘤细胞。（这个过程中还要注意肿瘤纯度的问题，用肿瘤的纯度乘以肿瘤的体积来排除基质细胞污染影响）

3. 亚克隆的检测和亚克隆的肿瘤组织体积有关：将找到的亚克隆突变比对回组织M-seq exome构建的进化树上，在57个多位点肿瘤里共有的亚克隆突变中有35个在ctDNA中被检测到（61%），而单位点特有的亚克隆突变有33%被检测到（26/80）。

3. 发现和描述非小细胞肺癌复发的特征

3.1    目的：长时间多点的跟踪研究，分析亚克隆分支的发展变化是否是非小细胞肺癌复发的诱因。

3.2    样品：24个病人术前和术后血液。在整个检测期间，有10例没有复发，另外14例是有确认复发。

3.3    芯片和方案设计：筛选LUAD和LUSC中主克隆和亚克隆突变位点。 LUSC中平均18.5个突变，包含平均8.5个主克隆SNVs和9.5个亚克隆SNVs。LUAD中平均28个SNVs，包含平均20.5个主克隆SNVs和6个亚克隆SNVs。

随访：前两年每三个月随访一次，每六个月进行一次临床评估和胸片检查。

Figure 4.术后ctDNA监测情况

结果：

1. 在复发前或复发后有13个（93%）NSCLC样品检测出至少两个SNVs。但是在临床上显示没有转移的样品中只有1个（10%）检测出至少两个SNVs。

2. ctDNA突变检出比临床上CT确诊复发早，平均时间间隔在70天（range，10-346days）。

3. 除此之外，ctDNA profiling还能够显示辅助化疗的耐药性现象（见Figure 4a-c）。

4. 通过比较术后ctDNA上检测到的亚克隆SNVs和多位点取样的原发癌SNVs，可以预测亚克隆突变是否参与肿瘤复发。在四个NSCLC复发病人的术后ctDNA发现其某个特定进化树分支上的亚克隆突变VAF和主克隆VAF相似（见Figure4b,f-g），这意味着该亚克隆突变在肿瘤复发的过程中占据主导地位。

4. 验证进化特征，展示术后辅助化疗过程中肿瘤进化特征

结果：患者CRUK0063（IIa期术后椎旁复发）在术后的231天里连续四次ctDNA检测到亚克隆突变（OR5D18），这个突变在原发癌进化树中存在。在术后467天CT发现转移组织，对转移组织进行外显子测序，推测包含OR5D18突变的亚克隆簇可能导致转移发生(见Figure5a)。

Figure 5.原发和复发系统进化树

5）ctDNA在转移样品中的追踪研究展示

样品：CRUK0063

取样过程如下：

    第0天：5个原发癌组织样品，M-seq；

    第467天：一块复发转移肿瘤组织样品；

    第857天：死亡，24小时进行尸检取样，取了6块肿瘤组织样品，M-seq；

分析内容1：三个不同时期的多个样品一起构建肿瘤发展进化树

结果：七个转移区域样品都是来自于同一个亚克隆簇8。其中6个转移的区域来自同一个稍晚一些的进化簇12。这个没有包含进化簇12的样品是尸检中的主动脉旁的转移样品，他有一个特别的亚克隆簇9（见Figure6b）。

分析内容2：设计ctDNA芯片panel追溯转移亚克隆的情况

20个主克隆SNVs +  9个转移亚克隆簇，每个平均数取8个的亚克隆SNVs（range，4-15）；芯片panel一共是103个SNVs

        术后151天：检测到2个主克隆SNVs；

        术后242天：检测到一个在进化簇8出现的亚克隆SNV；

        术后466天：临床上的表现是脊椎旁转移的时候，在共有进化树簇8,11,12中的20个SNVs有18个被检测到。其中特有的亚克隆簇5和9里也有snv被检测到。而这些亚克隆突变并没有在CT指导下的活检组织中被找到（第467天，见Figure6b）。

结果：

1. ctDNA的检测结果中的亚克隆VAF基本上和M-seq构建的进化树里的主克隆簇一致（见Figure6a,c）。而主克隆VAF由于受到放疗和化疗的影响在术后初期是减小的，在767天开始升高。

2. 死亡前90天，ctDNA里检测到1个SNV在进化簇5和9中出现，2个SNVs在进化簇2中出现。这三个进化簇反映了大动脉旁转移样品的亚克隆特性。在患者死亡前112天，CT影像并没有发现大动脉旁转移。

Figure 6.CRUK0063样品中致命性亚克隆突变的追踪研究

结论

1、多阶段实时ctDNA检测和靶向测序panel的设计，可以分析肿瘤中主克隆和亚克隆的进化情况，进一步揭示肿瘤转移的分子机制。

2、多重PCR NGS平台在SNVs频率>0.1%时，敏感性>99%,特异性99.6%。

3、肿瘤的体积和ctDNA中克隆SNVs的平均VAF突变频率相关。肿瘤体积在10 立方厘米大小时，ctDNA中VAF的突变频率为0.1%，检出率为99%以上。当体积为0.034立方厘米的时候，能够检测出VAF为1.4x10-4%的概率为95%。由此可见现在的技术， ctDNA检出的灵敏性主要受限于肿瘤的体积。

4、ctDNA可以用于监测肿瘤进化，反应化疗耐药及早期发现肿瘤复发等方面。

参考文献：

[1] Christopher Abbosh, Nicolai J. Birkbak, et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution[J].Nature, 2017, 545:446–451.