外泌体研究之砷慢性中毒会通过外泌体诱发肝癌

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南京医科大学公共卫生学院刘起展教授和贵州医科大学张爱华教授为共同通讯作者，最近在《Cell death&disease》杂志（IF=5.965）上发表了一篇关于亚砷酸盐致恶性转化的细胞通过外泌体传递circRNA到正常细胞，从而诱导其恶性转化的文章[1]。文章的思路简单清晰，逻辑性好，给临床医生或者想简单探讨外泌体功能的研究者提供研究策略的参考。

Dai X, et al. Cell Death Dis. 2018.

恶性细胞与旁边良性细胞之间的细胞间通讯参与了致癌过程。在致癌发生过程中，外泌体作为细胞间通讯的信使。circRNAs是一种功能性的非编码RNA，可以调节细胞周期和增殖。但是，外泌体中circRNAs功能还不清楚。这篇文章探讨了亚砷酸盐所致恶性转化的人肝上皮细胞（As-T-L-02）是否分泌circRNAs传递到正常的L-02细胞中，并诱导其恶性转变。

PS：作者之前研究[2]通过circRNA芯片分析亚砷酸盐致恶性转化后的人皮肤细胞（HaCaT cells）的RNA，发现皮肤细胞发生恶性转化后circRNA_100284 上调水平最高，人角质细胞的细胞周期加快，促进肿瘤发生。

1. 首先探讨circRNA_100284 在As-T-L-02细胞发挥致癌效应中的作用

亚砷酸盐处理L-02细胞后，L-02细胞中的circRNA_100284水平升高，具有时间依赖性和细胞代数依赖性。同时亚砷酸盐处理后细胞的锚着非依赖性生长能力增强（软琼脂中形成细胞克隆团数目），体内成瘤能力增强。As-T-L-02细胞经转染circRNA_100284的靶向siRNA后，circRNA_100284水平降低，细胞锚着非依赖性生长能力降低，细胞迁移和侵袭能力降低。在As-L-02-p20细胞（细胞代数20）过表达circRNA_100284后，细胞锚着非依赖性生长能力增强，细胞迁移和侵袭能力增强。

Figure. 1

Fig. 1A, B）RT-PCR检测不同处理时间和不同代数下circRNA_100284水平；（Fig. 1C, D）锚着非依赖性实验检测亚砷酸盐处理后细胞克隆团的形成和数目统计；（Fig. 1E, F）体内成瘤实验检测亚砷酸盐处理后L-02细胞的成瘤情况；（Fig. 1G, J）circRNA_100284的siRNA转染后，RT-PCR检测As-T-L-02细胞的cirRNA水平，锚着非依赖性实验检测细胞克隆团形成情况和transwell实验检测细胞的迁移、侵袭能力。

2. As-T-L-02细胞培养上清可以诱导正常L-02细胞circRNA_100284水平升高，细胞周期加快，细胞增殖能力增强

As-T-L-02细胞培养上清处理正常L-02细胞后胞内circRNA_100284水平升高，EZH2和Cyclin-D1的蛋白水平都升高，G1/S转变加快，细胞周期加快，细胞的增殖能力增强。

Figure. 2

As-T-L-02细胞培养上清处理正常L-02细胞后，（Fig. 2A）RT-PCR检测胞内circRNA_100284水平；（Fig. 2B, C）WB检测EZH2和Cyclin-D1的蛋白水平；（Fig. 2D, E）流式检测细胞周期各比例；（Fig. 2F）CCK8法检测正常L-02细胞的增殖能力。

3. As-T-L-02细胞分泌的外泌体被正常的L-02细胞摄取，导致其胞内circRNA_100284水平升高

提取到As-T-L-02细胞分泌的外泌体。进行TEM电镜（Fig. 3A）、NTA分析(Fig. 3B)、WB检测外泌体marker蛋白(Fig. 3C)和RT-PCR检测其包含的circRNA_100284水平(Fig. 3D)。最后通过confocal验证外泌体可以被正常L-02细胞摄取（Fig. 3E）。

 Figure. 3

4. As-T-L-02细胞分泌的外泌体circRNA_100284在正常L-02细胞周期加速中起重要作用

给予As-T-L-02细胞分泌的外泌体处理后，RT-PCR检测到正常L-02细胞的circRNA_100284水平升高（Fig. 4A），WB检测EZH2 和 cyclin-D1蛋白水平升高（Fig. 4E-H），流式检测细胞周期加快(Fig. 4B, C)，CCK8法检测细胞增殖能力增强（Fig. 4D）。给予经转染circRNA_100284 siRNA的 As-T-L-02细胞分泌的外泌体处理后，正常L-02细胞中circRNA_100284水平降低（Fig. 4I），EZH2 和 cyclin-D1蛋白水平不再升高（Fig. 4J, K），细胞周期G1/S转换降低（Fig. 4L, M）。

Figure. 4

5. As-T-L-02细胞分泌的外泌体circRNA_100284通过竞争结合miR-217促进正常L-02的细胞周期和增殖

由于作者之前的研究[2]就已经发现circRNA_100284可以作为miR-217的海绵（sponges），调控基因的表达，作者猜想并验证这里的效应也涉及到该机制。首先在数据库通过生物信息学方法预测了两者的结合位点（Fig. 5A）。正常L-02细胞经转染miR-217 mimics后，再给予As-T-L-02细胞分泌的外泌体刺激，WB检测EZH2 和 cyclin-D1蛋白水平降低（Fig. 5B, C）；正常L-02细胞经转染miR-217 抑制剂后，再给予经转染circRNA_100284 siRNA 的As-T-L-02细胞分泌的外泌体刺激，原本下调的EZH2 和 cyclin-D1蛋白水平恢复到正常水平（Fig. 5D），原本受到抑制的G1/S期转换恢复正常（Fig. 5E, F），原本降低的增殖能力也恢复正常（Fig. 5G）。

Figure. 5

6. As-T-L-02细胞分泌的外泌体circRNA_100284在促进正常L-02细胞发生恶性转化过程中发挥着重要作用

给予经转染circRNA_100284 siRNA的As-T-L-02细胞分泌的外泌体刺激后，锚着非依赖性实验检测As-L-02-p20细胞的细胞克隆团形成能力显著降低（Fig. 6A, upper, B），transwell实验检测L-02细胞的迁移和侵袭能力增强（Fig. 6A, lower, C），As-L-02-p20细胞体内成瘤能力显著降低（Fig. 6D, E）。

Figure. 6

7．长期暴露于亚砷酸盐的人群血清外泌体中circRNA_100284水平显著上调

Figure. 7

Fig. 7A) 人血清外泌体电镜鉴定；（Fig. 7B）RT-PCR分析人血清外泌体circRNA_100284水平。

参考文献

1. Dai X, Chen C, Yang Q, et al. Exosomal circRNA_100284 from arsenite-transformed cells, via microRNA-217 regulation of EZH2, is involved in the malignant transformation of human hepatic cells by accelerating the cell cycle and promoting cell proliferation. Cell Death Dis, 2018, 9(5):454   (PS:文章所有图均来自这条文献)

2. Xue J, Liu Y, Luo F, et al. Circ100284, via miR-217 regulation of EZH2, is involved in the arsenite-accelerated cell cycle of human keratinocytes in carcinogenesis[J]. Biochim. Biophys. Acta, 2017, 1863(3):753.

第四届circRNA研究论坛

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2018年7月7日-7月8日

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◎ circRNA 翻译蛋白研究策略分析
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◎ circRNA m⁶A甲基化研究策略
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