更小、更强大！Science：科学家为下一代基因编辑工具提供了新起点

CRISPR是细菌内部一种天然的“免疫系统”。当病毒入侵时，细菌可以捕获外来遗传物质的片段并将其整合到自身基因组的CRISPR序列中，随后通过Cas核酸酶精准切断病毒的DNA，从而抵御病毒入侵。可以说，CRISPR是大自然掷了数十亿次的骰子后（自然选择）产生的强大工具之一。

自从十年前，两位科学家首次证实CRISPR-Cas9可以在活细胞内编辑基因组以来，CRISPR便开创了自己的时代，从最初治疗遗传疾病，发展到艾滋病、癌症、慢性疼痛等多个治疗领域，利用基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术正在彻底改变生命科学。

CRISPR-Cas9系统使用RNA作为向导来识别DNA序列。当发现匹配对象时，Cas9蛋白会在正确的位置切割目标DNA，产生双链断裂，以实现在DNA水平上修复遗传疾病。

然而，还有最后一公里的问题有待解决：越来越多的尖端应用需要将基因编辑器有效递送到患者的每一个细胞中；而大多数Cas9太大，无法打包到目前成熟的基因组治疗载体中，如腺相关病毒（AAV）载体。在小型化RNA引导的核酸酶方面，无论是结构引导方法还是定向进化也都不是很成功。因此，科学家们对Cas9小型化以扩展基因编辑工具的使用范围产生了浓厚兴趣。

北京时间2022年5月27日，发表在《Science》上的一项最新研究中，来自康奈尔大学的研究团队通过利用大自然的成功解决方案，让Cas9小型化成为可能，从而为开发更小、更强大、更活跃的新一代基因组编辑工具提供了新起点。

之所以大自然的生命系统如此令人叹为观止，是因为一类奇特基因。越来越多的证据表明，CRISPR-Cas适应性免疫系统的核心成分可能是从这类奇特基因进化而来的。它就是转座子。

转座子（Transposon）是细菌内可移动的遗传元件，它的位移不依赖于序列的同源性。转座子被认为是CRISPR系统的进化前体。一个转座子谱系编码IscB，它的大小才不到Cas9的一半，但同样可以进行DNA编辑。因此，用IscB替换Cas9将最终解决大小问题。

在这项新研究中，研究人员精确地定义了转座子衍生系统如何以RNA引导的方式编辑DNA。

他们使用低温电子显微镜（Cryo-EM）对转座子系统中的IscB-ωRNA分子进行高分辨率可视化，从而捕捉到该系统在不同构象状态下的快照。 他们甚至还能通过从IscB中移除不必要的部分来设计更轻巧的IscB变体 。

研究通讯作者、康奈尔大学文理学院分子生物学和遗传学教授可爱龙说：“许多亮眼的应用需要基因编辑器与其他酶和功能融合，而大多数Cas9s已经太大了，无法通过病毒载体递送。我们正面临着传递端的交通堵塞。如果Cas9可以被打包在基因治疗领域已经用了几十年的病毒载体中，如AAV，那我们就可以确定它们可以被递送。因此，我们要把研究重点完全放在基因编辑工具本身的有效性上。”

该团队从低温电子显微镜收集的数据表明，IscB-ωRNA系统以类似的方式工作，其更小的尺寸是通过将Cas9蛋白部分替换为与引导RNA融合的结构化RNA（ωRNA）来实现的。 通过用RNA替代较大Cas9的蛋白质成分，IscB蛋白依然保持核心化学（DNA切割）反应中心。

IscB功能机制图

ωRNA的结构及其与Cas9 crRNA-tracrRNA的比较

该研究第一作者、微生物学系博士生Gabriel Schuler说：“这项研究让我们了解分子的结构以及它们如何进行化学反应。研究这些Cas9远古结构为我们提供了一个新的起点，可以生成更强大、更易于使用的基因编辑工具。”

可爱龙说：“转座子是专门的遗传搭便车者，一直在融入和剪接我们的基因组。特别是细菌内部的系统正在不断地被选择。大自然基本上已经掷了数十亿次的骰子，并产生了真正强大的DNA工具，包括CRISPR。现在，通过高分辨率定义它们，我们可以使用大自然的力量。”

与CRISPR Cas9相比，IscB更小，研究人员相信他们还可以将其缩得更小。他们已经在不影响IscB活性的情况下去除了55个氨基酸，并希望使下一代版本的基因组编辑工具更小、更强大，从而变得更加有用。

该研究共同第一作者、康奈尔大学分子生物学和遗传学系博士后胡纯一说，更好地理解伴生引导RNA的功能是这项研究背后的另一个动机。但仍然有很多谜团待解，例如为什么转座子使用RNA引导系统？这个RNA有没有可能还扮演着其他角色？

此外，研究人员仍面临的一个挑战是，虽然IscB-ωRNA在试管中非常活跃，但它在人类细胞中改变DNA的效率却不高。该团队下一步的研究将是利用分子结构来探索导致上述问题的可能性，并将其进一步优化。

论文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq7220