环境抗生素抗性基因研究进展丨研究

导     读

抗生素耐药性及其在全球范围内的传播已成为国际关注的热点。本文结合最新文献, 综述了抗生素抗性基因在环境中的来源、传播、分布以及新型抗性基因的发现等方面的研究进展。

环境中抗生素抗性基因的来源主要是环境中的内在抗性基因及随人或动物粪便排到体外的抗性细菌。功能宏基因组学技术的应用极大地丰富了人们对抗生素抗性组学的认知, 并已从环境中筛选到多种新型抗性基因。

近年来, 由于抗生素在医疗以及养殖业中的大量使用, 增加了抗性基因在环境中的丰度和多样性, 加速了抗性基因在环境中的传播, 在多种环境介质(如养殖水域、污水处理厂、河流、沉积物和土壤等)均检测到多种高丰度的抗生素抗性基因。我们建议今后在以下方面开展深入研究: (1)抗性基因传播和扩散的机制; (2)新型抗性基因筛选和抗性机制; (3)抗生素和抗性基因环境。

文/苏建强 黄福义 朱永官（中国科学院城市环境研究所城市环境与健康重点实验室）

来源：生物多样性（ 2013第4期）（/www.biodiversity-science.ne）

作为20世纪最重要的医学发现之一， 抗生素自被发现以来，已拯救了无数的生命, 为人类传染病的防治做出了重要贡献。

抗生素除了应用于医疗领域之外, 由于其预防疾病和刺激生长的作用，常以亚治疗剂量长期添加于饲料中, 在全球范围内广泛应用于养殖业中(Chee-Sanford et al., 2009; Pan etal., 2011; Hvistendahl et al., 2012; Qiao et al., 2012)。摄入人体或动物体内的抗生素大多未能被充分吸收和代谢, 而通过排泄物进入环境, 人为增加了对环境中微生物群落的进化选择压力。

近年来， 随着一些医疗保健药品和个人护理用品的频繁使用以及养殖业中抗生素的长期滥用，导致大量具有耐药性的细菌出现。这些抗性细菌在数量、多样性以及抗性强度上都显著增加, 许多菌株具有多重耐药, 甚至出现了能耐受大多数抗生素的“超级细菌”。

2011年德国爆发了“毒黄瓜”事件，疫情短期内在欧洲至少9个国家蔓延, 33人确认死亡，超过3,000人受感染，包括至少470人出现肾功能衰竭并发症。引起本次疫情的O104 : H4血清型肠出血性大肠杆菌是一种新型高传染性有毒菌株, 该菌株携带氨基糖苷类、大环内酯类、磺胺类等抗生素的耐药基因, 导致抗生素治疗无效。

2011年世界卫生日的主题“抵御耐药性——今天不采取行动, 明天就无药可用”, 就是号召要遏制抗菌素耐药性的蔓延。近年来虽然新型抗生素的发现和开发速度持续下降,但相关的抗生素抗性基因(Antibiotic ResistanceGenes, ARGs)却快速出现和扩散, 极大地影响了抗生素的治疗效果, 严重威胁人类健康。

Pruden等(2006)提出将抗生素抗性基因作为一种新型的环境污染物。与传统的化学污染物不同，抗生素抗性基因由于其固有的生物学特性，例如可在不同细菌间转移和传播甚至是自我扩增, 可表现出独特的环境行为。

在医疗领域, 对抗生素抗性细菌及抗性基因已有较为系统的研究, 对各类已知抗

性基因的分子机制已有较为清晰的认知, 主要包括以下几类: 

(1)通过对抗生素的降解或取代活性基团,改变抗生素的结构, 使抗生素失活;

 (2)通过对抗生素靶位的修饰使抗生素无法与之结合而表现出抗性;

(3)通过特异或通用的抗生素外排泵将抗生素排出细胞外, 降低胞内抗生素浓度而表现出抗性; 

(4)其他抗性机制包括在细胞膜上形成多糖类的屏障减少抗生素进入细胞内(Alekshun & Levy, 2007)。

近年来人们逐渐意识到抗生素抗性基因在环境中的持久性残留、传播和扩散比抗生素本身的危害还要大, 抗生素抗性基因的研究在环境科学研究领域也日益受到关注, 我国科学家建议尽快从国家层面上系统进行抗生素抗性基因的环境污染机理与控制对策研究(周启星等, 2007; 罗义和周启星,2008)。本文结合最新文献, 综述抗生素抗性基因在环境中的来源、传播、分布、新型抗性基因的发现等方面的研究进展, 并对今后的研究重点和方向提出了建议和展望。

1 环境中抗生素抗性基因的来源

1.1 内在抗性

环境中细菌的“内在抗性”(intrinsic resistance)是环境中抗性基因的重要来源。内在抗性是指存在于细菌的基因组上的抗性基因的原型、准抗性基因或平时没有表达的抗性基因(Davies & Davies,2010), 细菌可通过随机突变或表达潜在抗性基因而获得抗性。

在自然环境中的抗生素浓度通常低于临床使用的浓度。环境中这些低浓度抗生素均可作为微生物种群间或种群内的信号分子, 使微生物群落中的各微生物种群产生表型和基因型上的适应性反应(Aminov, 2009), 因此这些微生物种群普遍存在内在抗性基因。

多数天然抗生素来源于土壤微生物, 因此土壤中必然存在着相应的抗性基因。D’Costa等(2011)从北极3万年的冻土中提取到来自于晚更新世生物的

DNA, 发现存在多样性很高的抗性基因, 这些抗性基因对β-内酰胺类、四环素类和糖肽类等抗生素具有抗性。

进一步的研究发现其中万古霉素抗性蛋白的结构和功能与现代的变体极为相似(图1), 这表明一些类型的抗生素的抗性基因早就存在于自然界中, 而并非是由于现代临床治疗过程中抗生素的使用而造成。

Allen等(2009)从基本不受人类活动干扰的阿拉斯加冻土中筛选到多种新型的β内酰胺酶基因, 并首次发现了双功能的β内酰胺酶基因。随后Lang等(2010)从相同样品中筛选到新的氯霉素类抗性基因, 表明抗生素抗性基因同样存在于远离人类

活动的地区。

随着高通量测序技术的发展, 通过对多种细菌基因组和环境宏基因组的测序, 人们发现环境中存在着大量的潜在抗性基因以及与抗性基因水平转移相关的基因元件(Gillings et al., 2008;Fierer et al., 2012)。由于抗生素是抗性基因的选择压力, 随着环境抗生素污染的加剧, 可能加速了细菌抗性基因突变和抗性基因水平转移, 这些抗性基因一旦形成, 可能通过基因水平转移进入人类致病

菌内, 从而危害人类健康(Tello et al., 2012)。

1.2 外源输入

抗性细菌通过人或动物粪便随着肠道细菌排出体外, 是环境中抗生素抗性基因的重要来源之一。

最开始, 大多数抗生素主要是用于人体防治细菌感染, 因此多数抗性细菌最早也是在人体内被发现, 它们随着粪便排泄出体外, 进入医疗废水和生活废水中, 并排放到环境中, 而其携带的抗性基因即可通过水平转移传播到各种环境土著菌中。

因此,在医疗废水中抗性基因的检出率较高, 并常有多重耐药菌株检出(Webster et al., 2004; Jakobsen et al.,2008)。在我国, 医疗废水经医院内部的设施处理后

达标排放或经简单处理后直接汇入市政污水管道,最终进入城市污水处理厂作进一步处理。

但是, 抗生素在污水处理过程中很难被消除(Michael et al.,2012), 城市污水处理厂产生的含有抗生素和抗生素抗性的微生物随水体进入了环境中。此外, 污水

厂产生的污泥经填埋、露天堆放或堆肥农用后, 抗生素抗性基因也随着污泥进入周围环境和土壤环境中。

在动物养殖业中,抗生素的使用极大地刺激了抗性基因的发展。动物肠道内和粪便中含有丰富的抗性细菌和抗性基因,这样的粪便用作肥料后增加了农田土壤中抗性基因的丰度(Heuer et al., 2011)。

水产养殖业中, 动物粪便直接排放到水环境中, 使得水产养殖场频繁检测出抗性基因, 包括磺胺类和四环素类抗性基因, 且四环素抗性基因tet(E)存在于可转移的质粒上, 增加了其自身的迁移传播能力。

养殖和畜牧业废水中抗性基因的种类和浓度均较高, 甚至在饮用水和循环废水中均能检测到四环素和磺胺类抗性基因, 这些抗性基因可能对人类健康造成潜在的危害(Pruden et al., 2006)。

动物粪便施肥是动物体内的抗性基因进入土壤环境的主要途径, 在施用猪粪的农田土壤中可检测到高水平的抗性基因和抗性质粒(Knapp et al.,2010), 并可分离筛选到大量有较强抗性的菌株(Popowska et al., 2012)。

在中国3个城市的猪场附近土壤中, 检测到了15种四环素抗性基因, 并具有较

高丰度, 系统发育分析表明这些土壤样品中有5种基因型的四环素抗性基因tet(M)(Wu et al., 2010)。

Zhu(2013)等采用高通量的荧光定量PCR技术对我国3个城郊大型养猪场及周边地区采集的猪粪、猪粪堆肥和施用堆肥的土壤样品进行了检测和定量分析, 发现有63种抗性基因丰度显著高于没有施用抗生素的对照样品(192–21,600倍); 转座酶基因丰度最高可达对照样品的90,000倍, 而且与抗生素抗性基因的浓度成显著正相关, 暗示转座酶是引起抗性基因富集的原因之一。

他们的研究还发现, 抗性基因的丰度与环境中抗生素、重金属浓度均成显著正相关。这些结果表明抗生素的过度使用可引起抗生素抗性基因的富集, 并通过动物粪便排放到环境中; 高丰度的转座酶可能使得这些抗性基因转移到人类致病菌中, 危害人类健康。

2 环境中抗生素抗性基因的丰度、分布和传播

要正确评估抗生素抗性基因的生态风险、在环境中的分布、传播途径和机制, 需要对各个环境介质中的抗性基因丰度进行定量分析。实时荧光定量PCR技术是目前监测环境抗性基因丰度的有力工具。该技术已被应用于不同环境中, 包括养殖水域、污水处理厂、河流、沉积物和土壤等。

由于抗生素在水产养殖业中的大量投放, 水产养殖水域通常能检测到高丰度的抗性基因(高盼盼等, 2009)。Gao等(2012)在中国天津的6个养殖池中检测到了高比例的磺胺类和四环素类抗性基因, 其中磺胺类抗性基因要高于四环素类抗性基因。同样, 在污水处理厂尤其是活性污泥中存在着高丰度的抗生素抗性基因。

Liu等(2012)对土霉素工厂废水处理厂的四环素抗性基因进行的调查发现,在所检测的16种四环素抗性基因和5种基因转移元件中, 有9种四环素抗性基因和2种基因转移元件被检测到, 并且其丰度显著高于非抗生素工厂废水处理厂样品, 而且其中3种四环素抗性基因与整合酶基因(intI1)丰度成显著正相关。

Ma等(2011)研究了不同消化条件对活性污泥中四环素、大环内酯类和四环素类抗性基因丰度的影响, 发现厌氧处理可降低抗生素抗性基因的丰度, 但对整合酶基因丰度几乎没有影响, 进一步的研究表明这是由于其微生物群落变化所造成的。

受人类活动的影响, 在河水和河流沉积物中也可检测到高丰度的抗生素抗性基因。Luo等(2010)对中国海河流域河水和沉积物中的抗生素抗性基因检测发现, 四环素抗性基因在许多样品中未能检测到, 但磺胺类抗性基因sul1和sul2在所有38个样品中均能检测到, 其丰度高达1011拷贝每克沉积物;沉积物中的抗性基因是水样中的120–2,000倍, 且抗性基因丰度与磺胺类抗生素成显著正相关, 表明这些抗生素的存在选择性地富集了相应的抗性基因。

Pruden等(2012)研究了南佩雷特河上游人类活动对河水和沉积物中抗性基因丰度的影响, 结果表明四环素和磺胺类抗性基因丰度与动物养殖场和污水处理厂的分布显著相关, 并且与离它们的距离直接相关, 表明人类活动对抗性基因的传播有重要影响。

Drudge等(2012)的研究表明, 除了河水和沉积物外, 河流中的絮状悬浮物也富含抗性基因, 其中的整合酶基因丰度和多样性与絮状悬浮物的重金属浓度显著相关。Stoll等(2012)研究了24种抗性基因在德国和澳大利亚河流表层水中的分布, 他们发现磺胺类和甲氧苄氨嘧啶抗性基因是最普遍的, 在德国河水中大环内脂类抗性基因丰度较高, 而澳大利亚河水中氯霉素类抗性基因较高。

这些研究表明,河水和沉积物已成为抗性基因的库, 并可能加速了抗性基因的传播。虽然对环境中抗性基因的定量研究已取得了可喜的进展, 但目前多数研究采用的是传统的荧光定量PCR方法, 一般只能对几种或几十种抗性基因进行定量分析, 且多集中于四环素类和磺胺类抗性基因,这在一定程度上限制了人们对环境中抗性基因分布的认识。

新近发展起来的高通量荧光定量PCR技术可同时对多达上百种抗性基因或多个样品进行定量分析, 采用这种技术, Looft等(2012)发现在饲料中添加抗生素的猪肠道内的抗性基因丰度要显著高于未服用抗生素的对照。

Zhu等(2013)从我国3个城郊大型养猪场及周边地区分别采集了猪粪、猪粪堆肥

和施用堆肥的土壤样品, 采用了高通量的荧光定量PCR技术对样品中的244种抗性基因进行了检测和定量分析, 检测到149种抗生素抗性基因, 这些抗性基因涵盖了目前已知的主要抗性基因类型。

3 抗生素抗性组学

抗生素抗性组学(antibiotic resistome)是指微生物中所有抗生素抗性基因的集合, 是Wright 和D’Costa等(2006)提出的概念。

他们采用培养的手段发现土壤微生物中存在着高频度、高水平的抗性。抗生素抗性组包括所有的抗生素抗性基因(Wright,2007)。

这些基因包括在致病菌(pathogens)和抗生素产生菌(antibiotic producers)体内的抗性基因、隐藏在细菌染色体上通常不表达或低表达的抗性基因(cryptic embedded genes), 以及具有较低抗性或和抗生素密切相关、有可能进化为抗性基因的抗性基因前体(precursor genes)(图2) (Wright, 2007)。

Cheng等(2012)用7种抗生素从人类肠道微生物宏基因组文库中筛选到8个新的抗性基因, 这些基因分别对阿莫西林、D-环丝氨酸和卡那霉素具有抗性。

Sommer等(2009)采用功能宏基因组学的方法研究=第4 期苏建强等: 环境抗生素抗性基因研究进展 485了4个健康人群的口腔和肠道微生物抗性组, 构建了2个大小为9.3×109 bp的宏基因组文库, 进行13种抗生素的功能筛选, 并对筛选得到的抗性克隆子进行测序, 所发现的大部分抗性基因与现有数据库中的抗性基因相似性均较低, 平均为60.7%, 而采用培养手段分离出的抗性细菌的抗性基因多半与主要致病菌种的抗性基因相同, 由此他们认为在人体肠道微生物中发现的如此高多样性的抗性基因可能通过基因转移进入致病菌中使其获得新的抗性。

土壤由于具有丰富多样的微生物而被认为是抗性基因库。Riesenfeld等(2004)最早于2004年构建了土壤宏基因组文库, 筛选出9个表达氨基糖苷类抗生素抗性的克隆子和1个表达四环素抗性的克隆子,除了1个抗性基因之外, 其余所有抗性基因所编码的氨基酸序列都与先前报道的序列明显不同(相似度<60%)。

Allen等(2009)和Lang等(2010)对阿拉斯加冻土中的β内酰胺类和氯霉素类抗性基因进行了筛选, 从中发现了具有双重功能的β内酰胺酶和新的氯霉素外排基因。

Kazimierczak等(2009)利用有机猪的粪便DNA构建了有9,000个克隆子的基因组文库,并从中筛选到已知的tet(C)、tet(W)和tet(40)抗性基因, 以及1个新的与UDP-葡萄糖异构酶同源的四环素抗性基因, 并且筛选到的抗性基因多数和基因转

移元件结合在一起。

McGarvey等(2012)从华盛顿大学校园土壤中筛选到41个抗性基因, 这些抗性基因在氨基酸水平上与已知的抗性基因相似性很低, 彼此之间的相似性也很低, 其中有两个抗性基因编码的利福平ADP核糖转移酶在结构上存在较大差异,但二者抗性强度相似。

Forsberg等(2012)从土壤非致病菌中筛选到多种抗生素抗性克隆, 其中有16个抗

性基因在核酸水平上与致病菌的抗性基因完全一致, 其中许多抗性基因不仅在抗性基因编码区, 而且在非编码区及多种基因转移元件区的核酸序列也高度相似, 有力地证实了环境细菌和致病菌之间存在着抗生素抗性基因的交换和转移。

上述研究结果表明, 功能宏基因组学的方法是发掘环境中新型抗性基因的有力工具, 而新型抗性基因的高频率出现暗示着环境中的抗生素抗性基因种类和丰度远远超出我们的预料。

这些抗性基因可能威胁到人类的健康, 许多致病菌中的抗性基因来源于土壤。除了功能宏基因组学方法外, 随着高通量测序技术的发展, 人们可以采用直接测序的方性基因。

该方法虽然高度依赖于现有抗生素抗性基因的数据库完善程度, 但也在很大程度上避免了功能宏基因组方法在克隆偏好和异源表达方面的缺陷, 并可对不同环境中的抗生素抗性基因以及相关的基因转移元件的丰度和多样性进行比较, 在很大程度上拓展了抗性基因及转移传播机制的研究(Monier et al., 2011)。

4 研究展望

畜牧养殖业和医疗行业存在的长时间、过大剂量用药和不科学联用等滥用行为, 造成了一些抗生素抗性基因在人体和环境中r 种类、分布情况被人为改变, 其潜在的环境和健康风险已经引起了科学家、公众和政府的广泛注意。

然而目前对抗生素抗性基因的传播和扩散机制尚未有系统的研究, 同时, 针对环境中抗生素抗性基因这一新型环境污染物的潜在生态风险, 也尚未有较好的预警和评估体系。

我国是抗生素使用大国, 但在抗生素及相关抗性基因的环境行为和风险评估方面的研究还较为落后。因此在改革抗生素在畜牧养殖业和医疗保健行业的管控策略, 减少抗生素环境输入的同时, 应大力开展以下几方面的研究:

(1)在不同水平上开展抗生素影响环境微生物

群落进化的机制、抗生素抗性基因对环境中微生物多样性的影响、抗性基因在微生物中的分布及其在微生物之间转移的机理研究, 研发有效的处理技术, 降低医疗、生活和养殖业废水废弃物中抗性细菌和抗性基因的丰度。

(2)采用高通量PCR技术监测各类环境介质中

多种抗性基因的丰度, 获得系统的抗性基因环境分布数据, 分析环境因子(抗生素、温度、盐度、pH、氧等)对抗性基因传播扩散的影响及其机制, 并进而采用数学模型模拟的手段研究环境中抗性基因传播、扩散的机制, 从而制定相应策略控制抗性基因的传播。

(3)开展抗性基因的分子生态毒理学研究

 尤其针对细菌耐药性的产生机理进行深入研究, 减少细菌耐药性的产生, 建立抗生素和抗性基因环境风险评估体系, 并研究相应的控制和去除环境中抗生素和抗性基因污染的方法。

(4)采用功能宏基因组学技术挖掘环境中的新型抗性基因, 同时深入探讨新型抗性基因的抗性机制, 解析关键抗性蛋白的晶体结构, 从而为新型抗生素的研发提供数据, 这对保护人类健康具有重要意义。

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