肿瘤动物模型建立实验
诱发性肿瘤动物模型
实验方法原理
诱发性肿瘤动物模型是指研究者用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。
实验材料 肿瘤细胞小鼠
试剂、试剂盒 无血清培养基质3%中性甲醇石腊
仪器、耗材 低温离心机血球计数器游标卡尺
实验步骤
一、肝癌
1．二乙基亚硝胺（DEN）诱发大白鼠肝癌
（1）取体重250 g左右的封闭群大白鼠，雌雄不拘；
（2）按性别分笼饲养。除给普通食物外，饲以致癌物，即用 0.25%DEN水溶液灌胃，剂量为10 mg/kg，每周一次，其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中，任其自由饮用；
（3）共约4个月可诱发成肝癌；
（4）也可以单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。
2．4-2甲基氨基氮苯（DBA）诱发大鼠肝癌
（1）用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2 不应超过1.5～2 mg/kg；
（2）4～6月就有大量的肝癌诱发成功。
3．2-乙酰氨基酸（2AAF）诱发小鼠、狗、猫、鸡、兔肝癌
（1）给成年大鼠含0.03% 2AAF标准饲料；
（2）每日每平均2～3 mg 2AAF（也可将2AAF混于油中灌喂），3～4月后有80～90%动物产生肝肿瘤。
4．二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌：
（1）用剂量为每日0.3～14 mg/kg体重，混于饲料或饮水中给予；
（2）6～9个月后255/300大鼠发生了肝癌。
5．亚胺基偶氮甲苯（OAAT）诱发小鼠肝癌
（1）用1%OAAF苯溶液（约0.1 ml含1 mg）涂在动物的两肩胛间皮肤上，隔日一次，每次2～3滴，一般涂100次。
（2）实验后7～8周即而出现第一个肝肿瘤，7个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。
（3）或用2.5 mg OAAT溶于葵瓜子油中，给C3H小鼠皮下注射4次，每日间隔10天，也可诱发成肝癌。
6．黄曲霉素诱发大鼠肝癌
（1）每日饲料中含0.001～0.015 ppm，混入饲料中喂6个月后，肝癌诱发率达80％。
二、胃癌
1．甲基胆蒽诱发小鼠胃癌
（1）取20 g左右的小鼠，无菌手术下，在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽（MC）线结。
（2）含MC的线结是用普通细线，在一端打结后，将线结置于盛有MC小玻璃试管内，在酒精灯上微微加温，使MC液化渗入线结。MC浓度为0.05～0.1 g 20-甲基胆蒽内浸入10～20根线。
（3）手术埋线后4～8个月可诱发成功胃癌。
2．不对称亚硝胺诱发小鼠胃癌
剂量为0.25 ml/kg体重，3个月后全部动物发生前胃乳头状癌，7～8个月后有85～100%发生前胃癌。昆明种最敏感。A系次之，615系小鼠敏感性最差。
3．甲基亚硝基醋酸尿素诱发小鼠胃癌
给BD大鼠饮水中加甲基亚硝基醋酸尿素，剂量为2 mg/kg体重，每周饮用5次，520天后全部大鼠均发生了腺胃癌。
三、食管癌
1．甲基苄基亚硝胺（MBNA）诱发大鼠食管癌
（1）取体重100 g以上的Wistar大鼠；
（2）任其食用含甲基苄基亚硝胺的饮水，并将MBNA掺入饲料中使每日摄入量达0.75～1.5 mg/kg体重；
（3）80～100天可诱发成食管癌。
2．二烃黄樟素（Dihydrosafrole）诱发大鼠食管癌
（1）二烃黄樟素是一种制备啤酒的调味品，在大鼠饲料中加入百万分之二千五百至一万（2500～10000 ppm）黄樟素，就能引起20～75%的食管癌。
3．甲基苄基亚硝胺诱发大鼠食管癌
（1）用0.2%或0.005% 的甲基苄基亚硝胺水溶液，给动物经口灌喂，每天一次，大鼠灌注剂量为1 mg/kg体重；
（2）至第27天即发现一例食管乳头状瘤，154天发现第一例食管癌， 11个月食管癌的发生率为53%。
四、肺癌
1．二乙基亚硝胺（DEN）诱发小鼠肺癌
（1）小白鼠每周皮下注射1%DEN水溶液一次，每次剂量56 mg/kg，DEN总剂量达到868 mg；
（2）观察时间为100天左右时，发癌率可达40%。
（3）DEN总剂量达到1176 mg，观察时间为半年左右时；发癌率可达94%。
2．乌拉坦诱发肺腺癌
（1）小鼠（A系， 1～11/2月龄）较大鼠敏感，每次每只腹腔注入10%乌拉坦生理盐水液0.1～0.3 ml，间隔3～5日再注，共注2～3个月，每只小鼠用量约为 100 mg；
（2）注后3个月肺腺癌发生率为100%，而且多数为多发性，这种诱发瘤为良性。
3．苯并芘诱发肺腺癌
（1）猴气管内注入3，4-苯并芘（苯并花为3～15 mg与等量之Fe2O3混合液），每周一次，共10次；
（2）6只猴中有2只诱发肺的鳞状上皮癌。
4．硫酸铵气溶胶诱发肺腺癌
（1）用硫酸胺气溶剂给100只大鼠吸入；
（2）13个月后所有大鼠都发生了肺腺癌。
5．甲基胆蒽诱发肺腺癌
（1）用0.2%明胶作悬浮剂将甲基胆蒽混合后给金地鼠气管内注入，每次0.1 ml（含甲基胆蒽 5 mg）每周一次，共6次；
（2）53周后有62.5%动物发生了肺癌。
五、鼻咽癌
1．二甲基胆蒽（MC）诱发大鼠鼻咽癌
（1）取直径2～3 mm的硬质塑米管，在酒精灯上小火拉成锥形，每段长约3.5 cm，管内填以结晶体MC。
（2）小管一端用火封闭，以防药物外溢，尖端用针刺数孔，使MC能从小妃溢出。
（3）取体重120 g左右的大白鼠，雌雄均可，乙醚麻醉后，由前鼻孔将上述含MC的塑料小管插入鼻腔，利用前鼻孔较小管粗端为小的特点，稍加用力，迫使小管全部进入鼻腔内，其尖部可达鼻咽腔。不需另加固定，即可使小管长期留于鼻腔内。
（4）待到预定时间（半年以上），或动物自行死亡时，到其鼻咽部，10%福尔马林固定，脱钙后，石蜡包埋，进行连续切片。发癌率可达60%以上。
2．二乙基亚硝胺滴鼻法诱发鼻咽癌
（1）取120 g左右大白鼠，雌雄均可，乙醚麻醉后，用磨平针尖的8号针头，从前鼻孔轻轻插入，针尖可达鼻咽腔；
（2）经注射器灌注用1%吐温-80新配的 33.3%DEN混悬液0.0 2 ml(含DEN 6.7 mg)每周1次，共15～20次，可诱发成鼻咽癌。
六、宫颈癌
1．二甲基胆蒽（MC）诱发宫颈
取雌性小白鼠，以附有0.1 mgMC的棉纱线结在动物不麻醉的状态下，借助于阴道扩张器及磨纯的弯针，将线穿入宫颈。经右宫角背部穿出，使线结固定于宫颈口。线的另一端则固定于背部肌肉，缝合皮肤，挂线以后，同日开始连续注射青霉素2～3天。以防术后感染。至一定时间（半年左右）处死动物，宫颈组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片。
七、结肠癌
1．二甲基苄肼（Dimethlhydrazine，DMH）诱发鼻咽癌
（1）给四周龄的雄性大白鼠，皮下注射二甲基苄肼（Dimethlhydrazine，DMH）每周一次，连续21周，每次 DMH21 mg/kg；
（2）最后一次给药后1～4周，处死动物；
（3）降结肠部位用Bouin液固定，脱水，石蜡包埋，切片。所用之DMH先配成每100 ml含 400 mg的母液，并加EDTA37 mg，用氢氧化纳（0.1 N）液将pH调至6.5备用。
注意事项
1．要设计不同的实验组和对照组， 每组动物数一般为 5-10 只；
2．一般接种肿瘤6-8 周后，小鼠的肿瘤可生长至直径为 15-20mm ( 即小鼠会濒临死亡) 时， 可眼球取血，分离血清并保存血清， 处死小鼠， 取肿瘤组织照相， 取部分肿瘤组织作 冰冻组织切片( 或- 80℃ 保存)， 作相应的免疫组织化学染色 ， 取部分肿瘤组织用3%中性的甲醛固定， 石腊包埋， 作常规HE 染色。
其他
1．芳香胺及偶氮染料类致癌物的特点
（1）通常需要长期、大量给药才能致癌；
（2）肿瘤多发生于远隔作用部位的器官如膀胱、肝等；
（3）有明显的种属差异；
（4）其本身不是直接致癌物，致癌是由于其某种代谢产物的作用；
（5）其致癌作用往往受营养或激素的影响，例如，奶黄仅在以缺少蛋白质和核黄素的饲料喂饲大鼠时才引起肝癌，而且雄性大鼠较敏感，邻位氨基偶氮甲苯则易起雌性大鼠的肝癌。
2．亚硝胺类的致癌特点
（1）致癌性强，小剂量一次给药即可致癌；
（2）对多种动物（包括猴、豚鼠等不易诱发肿瘤的动物）的许多器官（包括食管、脑、鼻窦等不易引起癌的器官）能致癌，甚至可以通过胎盘致癌，如给怀孕大鼠以二乙基亚硝胺（Diethy lnitrosamine,DEN）可比较快地引起仔鼠的神经胶质细胞瘤；
（3）具有不同结构的亚硝胺有明显的器官亲和性，例如二甲基亚硝胺等对称的衍生物常引起肝癌，不对称的亚硝胺如甲基苄基亚硝胺常诱发食管癌；在大鼠，二丁基亚硝胺能引起膀胱癌，二戊基亚硝胺能诱发肺癌，而N-甲基-N-硝基-N-1-亚硝基胍则能引起胃肠癌。
3．黄曲霉毒素的致癌特点
（1）黄曲霉毒素的毒性很强，很小剂量（1mg/kg体重）即可使狗、幼龄大鼠、火鸡或小鸭致死；
（2）其致癌性也极强，最小致癌剂量比亚硝胺还要小数十倍，是已知化学致癌物中作用最强者；
（3）它能诱发多种动物（从鱼到猴）的肝癌，也可引起肾、胃及结肠的腺癌，滴入气管内可引起肺鳞状细胞癌；
（4）注入皮下可引起局部的肉瘤，还有报告认为，它可引起泪腺、乳腺、卵巢等其它部位的肿瘤。
4．其他
在动物实验中早已确定：乙硫氨酸可诱发大鼠肝癌；乌拉坦（氨基甲酸乙酯，C２H５O－CONH２）、氨乙胺可引起小鼠的肺癌；一些卤代烃如四氯化碳、氯仿等可引起大鼠或小鼠的肝癌。
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