实验专栏丨微生物污染常见问题

很多做实验的小伙伴，在培养细胞的过程中都是困难重重，最最常见的可能就是微生物感染细胞了，这一步骤轻则细胞重新培养，重则连带污染培养箱内的其他细胞，甚至整个实验室的环境，给科研工作带来严重的损失和威胁。

这一步若是没有跨过去，后面的实验根本无法进行啊，所以话不多说，我们马上开始今天的实验小课堂。

首先，我们要知道体外细胞污染可分为3 类: 物理性、化学性、生物性污染。其中生物性污染常见且造成的后果也较为严重，常见的生物污染类型有细菌污染、真菌污染、支原体污染、黑胶虫污染、原虫污染等。

（真菌污染图，图为本公司实验图，勿盗）

细菌污染：

细菌污染特点为污染速度快，易被发现。细菌污染后，PH 值改变。细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般1~2天会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

解决方法：

对于不是很珍贵的细胞，可丢弃。

若是很珍贵的细胞，建议分别配置含10倍双抗的PBS和5倍双抗的完全培养基各一份.先用10倍双抗的PBS洗涤细胞5-10次.然后用5倍双抗的完全培养洗涤细胞3次以上,并在其后每培养1小时换液一次,最后2倍双抗培养基培养过夜,第二天换成一倍双抗完全培养基继续培养,传代一次以上,如未发现污染,即可冻存,并留出部分细胞继续采用无双抗培养基培养48小时以上,最终确定细胞不含有任何污染物。

霉菌污染： 

培养液清亮，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，细胞仍可生长。但出现絮状杂质，污染后的镜下特点为: 低倍镜下可见乳白色的团状漂浮物，培养液无变化; 高倍镜下可见明显的菌丝，细胞活力变差，生长速度明显变慢，甚至死亡。污染的主要来源为实验人员( 实验服)。

解决方法:

霉菌污染初期，将污染的细胞培养液慢慢吸出，用Hanks 液清洗细胞及瓶壁2-3次，加入含有以下抗生素的培养液，即青霉素100单位/ml，链霉素100 单位/mL，两性霉素 10mg/L，24h 后观察换液，若仍有菌丝可重复上述步骤进行处理，2-3次后就基本得到控制。但此种方式处理后对细胞的生长影响也较大。

但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒

支原体污染：

常见的污染现象，特点为短期无变化，具有隐蔽性。它们可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化。污染后镜下特点: 在光镜下常可见到细胞核及胞浆内出现大小不等的颗粒或空泡。污染的主要来源为血清。而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。

解决方法：支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体。要注意的是：支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等是不敏感的； 所以主要的清除方法有抗血清处理法、高温处理法、巨噬细胞清除法、选择性杀灭哺乳动物类细胞培养物中支原体的方法，其中巨噬细胞清除法效果较好。

巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止。

黑胶虫污染：

可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化。其污染特点为开始对细胞无影响，当数量达到一定程度时就会对细胞产生影响。污染主要来源于血清。

解决方案：

对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。

细胞交叉污染：

由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。镜下可发现细胞的形态发生改变，与正常该细胞株的形态不同。

解决方案：

若发生细胞的交叉污染，通常不能挽回，只能放弃细胞。为避免细胞的交叉污染，在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别，并按顺序进行操作，避免一起进行时发生混乱，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

以上就是这节课的主要内容了，几种常见的微生物污染及其解决办法。同学们，下课！

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