实验专栏丨老司机带你玩转，扫描电镜样品制备！

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实验专栏丨老司机带你玩转，扫描电镜样品制备！

2017-11-15 中洪博元医学实验帮

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扫描电子显微镜样品制备比透射电镜样品制备简单，不需要包埋和切片。扫描电子显微镜样品的制备，必须满足以下要求。关于生物样品的制备，中洪君主要给大家讲的是化学方法和冷冻方法！

（请耐心花2分钟阅读完本文，建议推荐给小伙伴一起学）

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样本要求

扫描电子显微镜的优势为可以直接观察非常粗糙的样品表面，参差起伏的材料原始断口。但其劣势为样品必须在真空环境下观察，因此对样品有一些特殊要求，笼统的讲：干燥，无油，导电。

1、形貌形态，必须耐高真空：例如有些含水量很大的细胞，在真空中很快被抽干水分，细胞的形态也发生了改变，无法对各类型细胞进行区分；

2、样品表面不能含有有机油脂类污染物：油污在电子束作用下极端容易分解成碳氢化物，对真空环境造成极大污染。

3、样品必须保持充分干燥的状态，某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛发、昆虫、植物种子、花粉等，但图象质量差，而且观察和拍摄照片时须尽可能迅速。

4、样本需良好的导电性和较高的二次电子产额：对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。

5、特殊情况: 磁性材料，必须退磁。

对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。

（图片来源：网络）

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化学方法制备样品

化学方法制备样品的程序通常是：清洗、化学固定、干燥、喷镀金属。

1、清洗：某些生物 45 32773 45 14939 0 0 1221 0 0:00:26 0:00:12 0:00:14 3333 45 32773 45 14939 0 0 1146 0 0:00:28 0:00:13 0:00:15 3491料表面常附血液、细胞碎片、消化道内的食物残渣、细菌、淋巴液及粘液等异物，掩盖着要观察的部位，因而，需要在固定之前用生理盐水或等渗缓冲液等把附着物清洗干净。亦可用5%碳酸钠冲洗或酶消化法去除这些异物。

2、固定：通常采用醛类(主要是戊二醛和多聚甲醛)与四氧化锇双固定，也可用四氧化锇单固定。四氧化锇固定不仅可良好地保存组织细胞结构，而且能增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图象的质量。这对高分辨扫描电子显微术是极端重要的。为增强这种效果，可用四氧化锇-单宁酸或是四氧化锇-珠叉二胼等反复处理材料，使其结合更多的重金属锇，这就是导电染色。

3、干燥：固定后通常采用临界点干燥法。其原理是：适当选择温度和压力，使液体达到临界状态(液态和气相间界面消失)，从而避免在干燥过程中由水的表面张力所造成的样品变形。对含水生物材料直接进行临界点干燥时，水的临界温度和压力不能过高(37.4℃，218帕)。通常用乙醇或丙酮等使材料脱水，再用一种中间介质，如醋酸戊酯，置换脱水剂，然后在临界点干燥器中用液体或固体二氧化碳、氟利昂13以及一氧化二氮等置换剂置换中间介质，进行临界干燥。

4、喷镀金属：将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上，然后放在真空蒸发器中喷镀一层50～300埃厚的金属膜，以提高样品的导电性和二次电子产额，改善图象质量，并且防止样品受热和辐射损伤。如果采用离子溅射镀膜机喷镀金属，可获得均匀的细颗粒薄金属镀层，提高扫描电子图象的质量。

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冷冻方法制备样品

低温扫描电子显微术是20世纪80年代迅速发展和广泛应用的方法。它包括生物样品的冷冻固定、冷冻干燥、冷冻割断和冷冻含水样品的扫描电子显微术等。

1、冷冻固定：将生物材料投入低温的致冷剂中，如液氦、液氮、液体氟利昂及丙烷等。快速冷冻可使生物组织细胞的结构和化学组成接近于生活状态。被冷冻固定的生物样品，可以在低温条件下转移到具有低温样品台的扫描电子显微镜中直接观察无需进一步处理或仅在冷冻样品表面喷镀一薄层金属。这种方法不仅快速简便，而且可以排除由于干燥法造成收缩的假象，特别适合于研究含水量很高的生物材料。

2、冷冻干燥：生物样品经冷冻固定后，其中的水分冻结成冰，表面张力消失；再将冷冻样品放于真空中，使冰渐渐升华为水蒸气。这样获得的干燥样品在一定程度上避免了表面张力造成的形态改变。