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实验专栏丨当ELISA实验遇上社群，问题统统都粉碎
本次主要介绍ELISA实验的作用、双抗体夹心法的实验步骤、实验注意事项及测定结果分析，文末有惊喜，千万要坚持到最后。
ELISA（酶联免疫吸附）的作用
1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位；
2、研究抗酶抗体的合成；
3、显现微量的免疫沉淀反应；
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
双抗体夹心法实验步骤
一、双抗体夹心法检测未知抗原时：
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
二、双抗体夹心法检测未知抗体时：
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗体。 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
实验注意事项
1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
(2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3)酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4)酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
ELISA测定结果分析
ELISA的测定结果可分为两种：定性测定和定量测定。前者只需确定阴性或阳性即可；后者则需要给具体的数值。在定量测定中，经常要将标准品所获得的吸光值进行标准曲线的绘制。
下面则简单介绍用excel绘制标准曲线的方法：
1）输入相应数据：试管号相对应的浓度（mg/ml）与吸光度OD
2）选中相应数据：浓度（mg/ml）与吸光度OD
3）选择表格中，菜单栏中的插入散点图中第一个类型：
4）选中“图表工具”中的“快速布局”中fx图标，即可得到以下图表。Excel版本较低的可以直接跳到第6）步。
5）点中坐标轴标题，可做修改。修改后可获得以下标准曲线。
6）或者在较低版本的excel中，在“图表工具”选项中，选择趋势线|线性趋势线。
7）选中图表中的趋势线，右键，选择“设置趋势线格式”，在弹出的对话框中，将“显示公式”勾选上，点击关闭，也获得标准曲线。
8）可将试验管中所测的吸光度值代入图表中的公式后可得到所求成分的含量，即X的值。
最后，中洪君想说，由于近期后台咨询实验的用户越来越多，为了更好的让实验同仁们得到最及时的反馈和解答，本君创建了几个群组，分别为：
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