BioArt原创丨NgAgo波澜再现—Cell Res发文否定NgAgo基因编辑功能，附论文作者点评
11月11日晚上8点左右，Cell Research杂志以Letter to Editor形式在线发表了来自南通大学和复旦大学研究人员合作完成的题为“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的论文（下图），该文结果表明 gDNA/NgAgo 系统在斑马鱼中能实现特定基因敲低导致鱼眼部发育缺陷，但是不能对靶基因进行基因编辑。（注：文末附有该文通讯作者刘东博士和作者之一复旦大学王永明研究员的介绍和点评）
这篇文章中作者的研究的靶基因名为Fabp11a（Fatty acid binding protein 11a，脂肪酸结合蛋白11a），该基因在参与调解葡萄糖和脂代谢稳态方面具有重要作用，但是在斑马鱼胚胎发育中该基因的功能未知。对此，作者想知道NgAgo系统是否能在斑马鱼中工作，针对Fabp11a基因设计了两条5'-磷酸化的ssDNA（下图1），与优化过的NgAgo-2nls mRNA一起注射到1细胞期的胚胎中，有趣的是他们观察到注射过的胚胎中最终约有30%会产生严重的眼部发育表型。第一类表型：眼部有一只相对小一点的眼睛而另一只显得十分小；第二类表型：两只眼睛融合形成一只较大的眼睛（见下图2）。
图一
图二
为了证明是否斑马鱼出现的表型是由于Fabp11a基因遗传突变造成的，作者抽提了正常斑马鱼胚胎和突变斑马鱼胚胎的DNA对靶基因进行PCR扩增，结果测序结果表明靶基因没有发生任何基因突变，但是通过RT-PCR检测Fabp11a基因的表达惊奇的发现该基因的表达有显著敲低（见下图E）。
为了更清楚的说明问题，作者进一步做了一些实排除了单独由NgAgo-2nls mRNA或者gDNA注射到胚胎导致的表型，而且同时注射NgAgo-2nls mRNA和错配的gDNA也不会产生表型，这些实验结果表明gDNA/NgAgo系统有其特异性。另外实验结果表明gDNA/NgAgo系统靶向敲低Fabp11a基因导致的斑马鱼眼部的表型可以通过注射Fabp11a mRNA回复表型（见上图D）。
为了进一步确认gDNA/NgAgo系统在斑马鱼中敲低基因是一种普遍的现象，作者又test的另外一个基因ta（no tail/ntl or brachyury），结果表明也有大约30%注射过的胚胎出现没有尾巴的表型（见下图）。
此前韩春雨NBT文章中表明gDNA/NgAgo系统在人源细胞（37℃）中能够有效的产生11.2%-41.3% 的indels。Cell Res这篇文章中也在37℃的条件下检测了斑马鱼中gDNA/NgAgo系统是否能产生indels，结果表明没有检测到任何indels发生。有趣的是在正常情况下，斑马鱼胚胎中注射gDNA和酶活突变的NgAgo mRNA也能产生系列表型，当然同样检测不到任何indels的发生。为了再进一步确认斑马鱼的表型是由于Fabp11a敲低造成的，作者还做了一些后续的原位杂交实验，而且还运用CRISPR/Cas9技术敲除Fabp11a基因也能得到相似的表型，当然基因敲除的表型显然异常剧烈一些，有约10%的胚胎出现眼睛消失的表型。
总的来说，这项研究结果通过使用gDNA/NgAgo系统在斑马鱼中实现了特定基因的敲低，但是没有检测到靶基因上任何indels的出现，因为酶活突变的NgAgo也能产生敲低的效果，作者猜测这个系统可能和酶活突变的Cas9：sgRNA系统类似都能在靶基因处抑制基因转录。
论文作者简介
刘东博士
这项工作是由南通大学江苏省神经再生重点实验室刘东副教授领衔完成，根据该实验室官网资料显示，刘东于2011年从德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心/柏林自由大学获得自然科学博士学位，从2012年8月起任南通大学神经再生重点实验室副教授，2013年起担任硕士研究生导师，目前是中国解剖学会再生医学专业委员会委员，江苏省发育与细胞学会理事，其主要研究方向为：
1、鉴定参与血管新生以及神经系统发育过程中的全新的调控分子。
2、组织再生过程中血管化的过程及调控机制。
3、利用多种遗传操作技术建立转基因和基因敲除斑马鱼模型。
4、筛选调控血管内皮细胞和运动神经元行为的天然化合物。
论文另一位合作者是来自复旦大学生命科学学院的王永明研究员，他曾于2015年入选中组部青年千人计划，主要研究方向是建立高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术用于通过建立疾病模型和筛选相关治疗药物等。
独家评论
文章的通讯作者刘东博士对该项该项研究的说明（微信采访）：我们的研究是在斑马鱼模型上做的，我们没有发现indels，但是可以抑制基因表达，推测是结合到了DNA上，阻止了转录。并没有支持或者反驳韩教授的结果。实际上这个研究是我们意外的一个小发现。
刘东博士课题组合影（图片由刘东博士提供）
文章共同作者之一王永明研究员对该项工作的介绍和点评（微信语音采访）：这个工作大约在韩春雨NBT文章发表后一个月开始着手的，然后前后大约做了5个月，最初的想法是运用这个新技术在斑马鱼里对自己感兴趣的基因实行基因编辑，看看效果怎样，但是并没有想到是如今论文报道的这个结果。在斑马鱼里以前主要是用morpholino的手段敲低基因表达，但是这个文章告诉我们gDNA/NgAgo系统也能实现目的基因的敲低并且效率上也有一定优势，所以这个工作对于在斑马鱼里敲低基因表达还是十分有意义的。
温州医科大学谷峰教授（13位实名呼吁对韩春雨启动调查的学者之一）对该项工作的点评和疑问：
本研究原预期目的是希望能够在模式生物斑马鱼上利用韩春雨的研究工具（发表在NBT杂志）来研究一个未知基因功能，具体是试图利用NgAgo工具去解析Fabp11a基因在斑马鱼发育中作用，但是并没有获得类似韩春雨在人类细胞中基因编辑的结果（对应的靶基因序列产生In/del）。但是仍然发现少量斑马鱼有表型，在此基础上，通过进一步研究发现，NgAgo/5'p-gDNA系统可能具有基因表达调节的功能，也就是NgAgo/5'p-gDNA通过knock-down去调节Fabp11a基因的功能。该结果在其他基因中得到验证。
这个研究蛮新颖的，但是仍然有几个相关问题可能需要去回答:
1. NgAgo加了核定位信号（NLS），是否一定需要在细胞核中发挥作用？如果把核定位信号去掉，是否也能够发挥作用？是否一定需要5'磷酸化的单链DNA（5'p-gDNA），非磷酸化也会有一样的knock-down效果吗？双链DNA效果如何？
2. 利用Fabp11a对应的mRNA进行补偿实验，是否有剂量依赖关系？而NgAgo/5'p-gDNA是否能够作用Fabp11a对应的mRNA？
3. NgAgo/5'p-gDNA似乎显示比翻译抑制工具 Morpholino（斑马鱼研究基因功能的一个工具）对基因的knock-down更有效，这个系统是否在哺乳动物细胞也一样好用呢？
4. 这个研究提示，NgAgo/5'p-gDNA可能是在转录水平起作用的，是否是直接与DNA结合起作用的？北京大学孙育杰教授利用图像工具研究，发现NgAgo/5'p-gDNA无法结合在靶基因对应的基因组位置（网络上有的），似乎与本研究的提示不一致。
美国克利夫兰医学中心从事基因转录调控研究某博后点评：作者认为是一种类似于dCas9的抑制作用。但是首先作者没有显示NgAgo有直接结合到染色体DNA上的能力。而且dCas9是要和KRAB 融合表达以后才能抑制基因转录，dCas9 本身对基因转录抑制作用比较有限。这样需要sgRNA的target 位点在TSS附近，这篇文章的2个guide RNA离转录位点有点太远了。不太可能是通过这种机制。其实做一个pol2 ChIP就知道是否是通过抑制了基因转录。
丹麦奥胡斯大学博后蔡宇伽博士点评：
双十一，刘东研究组在Cell Research发表了一篇非常吸引眼球的NgAgo文章。他们在斑马鱼中观察到了类似RNA干扰的现象，而非此前广受争议的基因敲除。这个现象其实是在意料之中，因为此前，诸多小组在重复韩春雨NgAgo的文章的时候，普遍反应可以观察到gfp基因表达下调。斑马鱼适宜的生活温度是28.5度左右，在此温度下作者没有观察到基因敲除。由于NgAgo的活性可能跟温度有关，为此，作者特意把斑马鱼胚胎放置37度，尽管此时作者依然可以观察到基因表达下调的现象，但是还是没有观察到基因敲除。NgAgo介导的基因表达下调机理现在还不清楚。有可能在转录阶段，但也有可能是在蛋白翻译阶段。如果NgAgo通过与DNA结合干扰基因表达，那么即使它不直接切割DNA也可以开发出一些有意思的工具，包括荧光定位及与FokI结合定点切割DNA。
BioArt点评：这篇文章的所有工作都是在斑马鱼中做的，而不是直接重复韩春雨NBT论文中的工作，实验结果清楚的表明gDNA/NgAgo系统能在体内特异性的一致靶基因的表达，但是不能对基因进行切割，这篇文章虽然没有在论文中直接表明是支持了还是否定了韩春雨的工作，但是实验结果清楚的告诉我们gDNA/NgAgo系统至少在斑马鱼中不能够实行基因编辑，间接的否定了NBT的结果。事实上这个结果并不奇怪，其实最早北大魏文胜教授实验室的结果也表明gDNA/NgAgo系统在293T细胞中能敲低目的基因而不能实现基因切割，笔者还询问过曾经在小鼠胚胎中注射gDNA/NgAgo的资深研究人员，他也表示在小鼠胚胎中也有类似的敲低现象发生。所以总的来说，这篇论文的报道并不代表韩春雨老师NBT的工作被证实了，后续可能还需要相关的工作去进一步解释说明，特别是解释RNAi的机制是什么，或许结构生物学能给出一些答案。
（致谢：感谢Cell Research编辑汪劼博士及时提供的信息，感谢论文通讯作者刘东博士和论文共同作者之一王永明研究员对该项研究工作的介绍和点评，感谢谷峰教授百忙之中对这项研究的点评，感谢蔡宇伽博士的点评，感谢华东师范大学李大力教授对本文的审阅，感谢BioArt顾问委员会的成员提出的宝贵意见。）
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