【专家点评】刘默芳组Cell首次揭示Piwi突变导致男性不育的分子机理丨BioArt特别推荐

BioArt按：piRNA是近年来在动物生殖细胞中发现的一类非编码小分子RNA，它可以与PIWI蛋白相互结合形成PIWI/piRNA“机器”，在动物生殖细胞发育分化过程中发挥重要作用。2013年刘默芳课题组就已经发现了小鼠piRNA在精子形成后期触发其结合蛋白PIWI（MIWI）经APC/C-泛素化降解的新途径和piRNA诱导PIWI降解的新功能，为精子形成异常导致的男性不育症发生提供了潜在的分子信息。那么PIWI突变是否会导致雄性不育，更准确的说人类不育症患者中是否存在PIWI突变？5月25日，来自中科院生化与细胞所的刘默芳研究组和上海计划生育科学研究所施惠娟研究组合作在Cell上发表了题为“Ubiquitination-Deficient Mutations in Human Piwi Cause Male Infertility by Impairing Histoneto-Protamine Exchange during Spermiogenesis”的研究论文，该研究首次发现了PIWI蛋白突变致男性不育并深入揭示了相关的致病机理，还发现了在精子变形过程中引发组蛋白-鱼精蛋白转换的新机制，为相关男性不育症的精准医疗提供了理论基础和方法策略。鉴于该工作在理论研究上的重要突破和潜在的应用前景，BioArt特别邀请了中科院动物所陈大华研究员和中科院生物物理所俞洋研究员撰写相关评论，以飨读者！论文通讯作者为刘默芳和施惠娟，第一作者分别为苟兰涛、康俊炎、戴鹏、王鑫和李锋。特别值得一提的是，这是今年5月份，国内独立完成的第四篇研究型Cell论文，也是中科院上海生化与细胞研究所的第二篇文章（陈玲玲、施一公、季维智/孙毅/陈永昌、刘默芳），BioArt对上述成果都在第一时间做了详细报道。

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论文解读：

撰文丨丁广进

点评丨陈大华研究员    俞洋研究员

piRNA是近年来在动物生殖细胞中发现的一类非编码小分子RNA。2006年，有4个独立的课题组几乎在同一时间报道了一类与PIWI家族蛋白相互作用的小分子RNA，长度约为24~32 nt，因为与PIWI蛋白相互作用，故称为PIWI-interacting RNA，简称piRNA。值得一提的是四篇论文中，其中一篇文章是来自耶鲁大学林海帆教授实验室（相关工作是在杜克大学任职期间完成的）【1-4】。

piRNA起源于基因组中的反转座子、重复序列及一些被称为piRNA簇的区域，piRNA与PIWI蛋白相互结合形成PIWI/piRNA“机器” ，可以通过在表观遗传水平和转录后水平沉默转座子、反转座子等移动元件，维持生殖细胞自身基因组的稳定性和完整性，在配子形成过程中发挥重要作用。刘默芳实验室及其他国际同行实验室最近的研究显示，PIWI/piRNA机器也参与调控生殖细胞中编码基因的表达。对PIWI/piRNA“机器” 生物学功能及意义的研究，可以为相关男性不育症的诊断和治疗提供理论基础，具有十分重要的意义【5】。

生殖细胞特异性表达的PIWI家族蛋白是piRNA作用途径的中心，是piRNA的生成及功能所必需。小鼠PIWI家族包括MILI、MIWI和MIWI2三个成员，特异性地在睾丸中表达，对小鼠精子发生至关重要。

刘默芳研究组近年来围绕“piRNA在哺乳动物精子发生中的功能和机制”方面做了大量系统的研究，取得了多项重要成果。这些成果包括，发现piRNA通过泛素-蛋白酶体途径调控其结合蛋白MIWI及自身的降解代谢，并首次揭示了PIWI/piRNA的代谢调控机制以及piRNA调控泛素化途径的新功能(Dev Cell 2013)； 小鼠粗线期piRNA指导父本mRNA在精子形成后期大规模降解(Cell Res 2014)；发现了小鼠piRNA可直接介导部分睾丸mRNA的切割，揭示了piRNA可在小鼠睾丸组织中发挥siRNA类似的功能，而且该功能为雄性生殖细胞发育成熟所必需（Cell Res 2015）。值得一提的是，有关MIWI的代谢异常造成精子细胞发育受阻的研究，为精子形成异常导致的男性不育症发生提供了潜在的分子信息。

2013年刘默芳研究员课题组与王恩多院士课题组合作在Dev Cell杂志上揭示了piRNA通过泛素-蛋白酶小体途径调控其结合蛋白MIWI及自身的降解代谢，并首次揭示了PIWI/piRNA的代谢调控机制以及piRNA调控泛素化途径的新功能

而刘默芳研究组这篇最新的Cell论文在此前相关研究的基础之上，发现了无精/少弱精症患者存在拮抗人PIWI（HIWI）泛素修饰的基因突变，通过小鼠模型证明此类突变导致雄性不育，并深入揭示了其致病的分子机制。

此前在许多研究PIWI的动物模型中都证明了PIWI对生殖细胞发育的分化的重要作用，然而PIWI在人类生殖细胞发育分化中的功能并不清楚。那么作者首先提出的科学问题就是，PIWI在人类生殖细胞形成中具有什么作用？人类不育患者中是否存在PIWI突变？为了回答上述问题，作者首先检测了413例无精症患者（300例健康人群作为对照）Piwi基因（人类中又称为Hiwi）上一个在脊椎动物中十分保守的D-Box序列中是否存在突变。测序结果显示，该课题组非常幸运地发现了3例无精症患者身上存在Piwi D-Box突变（下图）。生化实验检测发现这类突变导致了PIWI蛋白泛素化缺陷，但是不影响PIWI对靶RNA分子的切割作用以及piRNA-loading的功能。

图为测序检测到的3例无精症患者身上存在Piwi D-Box突变

为了进一步验证确实是Piwi D-Box突变是否确实可以导致的男性不育症的发生，那么接下来就很有必要构建条件性Piwi D-Box突变knock-in小鼠模型，小鼠模型显示条件性Piwi D-Box knock-in突变后，小鼠出现雄性不育、精子形态异常以及细胞核结构疏松（下图）。随后通过质谱检测发现，条件性Piwi D-Box knock-in小鼠精子中还存在多种蛋白异常表达。 

图为正常雄性小鼠精子和Piwi D-Box knock-in小鼠精子形态上的差异

了解精子发育过程的人们应该知道，精子发育在结构特化的过程中会发生“组蛋白-鱼精蛋白转换（Histone-to-Protamine exchange）”（下图）。

2010年，Dev Cell杂志报道了RNF8介导的组蛋白泛素化启动了精子变形过程中的“组蛋白-鱼精蛋白转换”（下图）。

有了上述研究背景，作者马上就想到检测小鼠精子中组蛋白泛素化修饰是否发生了变化。果然，条件性Piwi D-Box knock-in小鼠的后期精子细胞中组蛋白泛素化水平显著下降（下图）。

Piwi D-Box knock-in小鼠精子中组蛋白H2B泛素化水平大幅下降

然而上述这个过程中的分子机制又是什么呢？随后的生化实验表明，MIWI（PIWI）可以与RNF8相互作用，抑制了RNF8入核泛素化组蛋白。Piwi D-Box突变不仅导致MIWI突变体蛋白在细胞质中的累积，而且抑制了RNF8泛素连接酶入核，从而影响精子发生过程中组蛋白的泛素化以及进一步的“组蛋白-鱼精蛋白替换”过程。进一步实验表明RNF8-N（N端1-210aa）足以竞争RNF8全长蛋白和MIWI的结合作用。好玩的是，在Piwi D-Box突变的精子中过表达RNF8-N可以rescue精子的活力（下图）。

总的来说，这项研究的重要意义在于首次发现人类Piwi基因突变可导致男性不育，深入揭示了其致病机理，并为相关男性不育症的精准医疗提供了理论基础和方法策略。

工作模型

专家点评：

陈大华  （中科院动物所研究员，国家“杰青”，中国科学院大学教授，“长江学者”）

Comments：模式动物（如果蝇和小鼠）的研究表明，Piwi家族蛋白在调控piRNA的生物发生、转座子沉默以及生殖细胞的发育发挥重要作用。刘默芳研究组前期工作（Dev Cell, 2013）发现生殖细胞中MIWI蛋白的稳定性，通过其D-box受到APC/C复合物的严格调控。该研究在前期工作基础上，通过对男性先天无精症患者的筛查以及动物模型的分析，意外的发现了PIWI蛋白的新功能：D-box突变不仅导致MIWI突变体蛋白在细胞质中的累积，而且抑制了RNF8泛素连接酶入核，从而影响精子发生过程中组蛋白的泛素化以及进一步的组蛋白-鱼精蛋白的替换过程。有趣的是，通过抑制MIWI与RNF8之间的结合可以挽救这一突变精子的活力。该项研究不仅诠释了PIWI蛋白在调控精子发生中的新机制，同时也为HIWI突变-相关男性不育临床治疗提供了新思路。

俞洋 （中科院生物物理所研究员，“青年千人”）

Comments：Piwi家族蛋白和它所结合的piRNA是在动物的生殖细胞中非常重要。该通路的突变通常会导致哺乳动物不育，其中一个主要原因是转座子跳跃导致的基因组损伤。通常认为Piwi家族蛋白要执行其生物学功能，要依靠它结合piRNA作为“向导”。而中科院上海生化与细胞所刘默芳老师的最新研究表明，小鼠的Piwi家族蛋白（MIWI）在圆形精子形成后，还肩负着调控“组蛋白-鱼精蛋白转换（Histone-to-Protamine exchange）”的重要任务。十分有趣的是，MIWI的这项重要生物学功能从小鼠到人类都是保守，但却似乎独立于其结合的piRNA。刘老师的发现不但解释了部分男性不育病例的分子机制，并为将来设计治疗方案提供线索，还为Piwi家族蛋白的功能与相关机理研究开拓了一个全新的思路。大家不禁想问的是：类似的调控机制是否存在于其它物种，特别是那些在精子发生过程中存在组蛋白替换的生物？由于刘老师研究的是MIWI在圆形精子形成之后的功能，而MIWI全基因敲除小鼠的生殖细胞发育会停止在圆形精子时期，那么一个有待探索的问题是MIWI蛋白结合的piRNA在减数分裂粗线期的生物学功能到底是什么？

参考文献：

1、Aravin, A., Gaidatzis, D., Pfeffer, S., Lagos-Quintana, M., Landgraf, P., Iovino, N., ... & Chien, M. (2006). A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes. Nature, 442(7099), 203-207.

2、Girard, A., Sachidanandam, R., Hannon, G. J., & Carmell, M. A. (2006). A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins. Nature, 442(7099), 199-202.

3、Grivna, S. T., Beyret, E., Wang, Z., & Lin, H. (2006). A novel class of small RNAs in mouse spermatogenic cells. Genes & development, 20(13), 1709-1714.

4、Watanabe, T., Takeda, A., Tsukiyama, T., Mise, K., Okuno, T., Sasaki, H., ... & Imai, H. (2006). Identification and characterization of two novel classes of small RNAs in the mouse germline: retrotransposon-derived siRNAs in oocytes and germline small RNAs in testes. Genes & development, 20(13), 1732-1743.

5、戴鹏, 苟兰涛, & 刘默芳. (2014). PIWI/piRNA “机器” 与雄性生殖细胞发育. 生命的化学, 34(004), 456-465.

推荐阅读：

刘默芳研究员简介

刘默芳，博士，现任中科院生化与细胞所研究员，国家“杰青”。分别于1991年、1994年在华东理工大学获学士、硕士学位，2000年在中科院上海生物化学研究所获博士学位。分别于2000 -2005年、2005-2006年在美国国家健康研究院癌症研究所 (National Cancer Institute, NIH)博士后研究、约翰霍浦金斯医学院遗传和分子生物学系任研究助理。2006-至今，中科院生化与细胞所，先后担任co-PI、RNA研究技术平台主任、研究组长（PI）。2013年入选国家杰出青年科学基金获得者。刘默芳研究组从事非编码RNA功能机制研究，主要围绕piRNA与哺乳动物精子发生、 microRNA与人类癌症等开展较系统的探索。近期工作先后发现小鼠piRNA及其结合蛋白MIWI在后期精子细胞中协同降解的调控机制(Dev Cell 2013)、 小鼠粗线期piRNA指导父本mRNA在精子形成后期大规模降解(Cell Res 2014)；发现了小鼠piRNA可直接介导部分睾丸mRNA的切割，揭示了piRNA可在小鼠睾丸组织中发挥siRNA类似的功能，而且该功能为雄性生殖细胞发育成熟所必需（Cell Res 2015）；同时还发现microRNA在炎症相关肿瘤发生及肿瘤细胞代谢中具有极其重要的调控作用 (Cancer Res 2017； Oncogene 2016； EMBO J 2015； Cancer Res 2014； Cell Res 2014； EMBO J 2012； Cell Res 2012； Cancer Res 2010)。这些原创性研究成果揭示了小分子非编码RNA的生理和病理功能机制, 可为男性不育症及肿瘤等疾病的诊治研究提供理论依据和相关基础。

近年来代表性工作：

1. Gou LT, Kang JY, Dai P, Wang X, Li F, Zhao S, Zhang M, Hua MM, Lu Y, Zhu Y, Li Z, Chen H, Wu LG, Li D, Fu XD, Li J, Shi HJ*, Liu MF*. Ubiquitination-deficient Mutations in Human Piwi Cause Male Infertility by Impairing Histone-to-Protamine Exchange during Spermiogenesis. Cell (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.04.034. 

2. Yuan P, He XH, Rong YF, Cao J, Li Y, Hu Y, Liu Y, Li D, Lou W*, Liu MF*. KRAS-NFκB-YY1-miR-489 signaling axis controls pancreatic cancer metastasis. Cancer Res, 2017, 77:100-111.

3. He XH, Zhu W, Yuan P, Jiang S, Li D, Zhang HW, MF Liu*. miR-155 downregulates ErbB2 and suppresses ErbB2-induced malignant transformation of breast epithelial cells. Oncogene, 2016, 35(46):6015-6025.

4. Zhang LF, Lou JT, Lu MH, Gao C, Zhao S, Li B, Liang S, Li Y, Li D, Liu MF*.  Suppression of miR-199a maturation by HuR is crucial for hypoxia-induced glycolytic switch in hepatocellular carcinoma. EMBO J, 2015, 34:2671-2685.

5. Zhang P, Kang JY, Gou LT, Wang J, Xue Y, Skogerboe G, Dai P, Huang DW, Chen R, Fu XD*, Liu MF*, He S*. MIWI and piRNA-mediated cleavage of messenger RNAs in mouse testes. Cell Res, 2015, 25:193-207.

6. Wang L, Zhang LF, Wu J, Xu SJ, Xu YY, Li D, Lou JT*,Liu MF*. IL-1β-mediated repression of microRNA-101 is crucial for inflammation-promoted lung tumorigenesis. Cancer Res, 2014, 74:4720-4730.

7. Gou LT, Dai P, Yang JH, Xue Y, Hu YP, Zhou Y, Kang JY, Wang X, Li H, Hua MM, Zhao S, Hu SD, Wu LG, Shi HJ, Li Y, Fu XD, Qu LH, Wang ED, Liu MF*.  Pachytene piRNAs instruct massive mRNA elimination during late spermiogenesis. Cell Res, 2014, 24:680-700.

8. Hu S, Zhu W, Zhang LF, Pei M, Liu MF*.  MicroRNA-155 broadly orchestrates inflammation-induced changes of microRNA expression in breast cancer. Cell Res, 2014, 24:254-257.

9. Zhao S, Gou LT, Zhang M, Zu LD, Hua MM, Hua Y, Shi HJ, Li Y, Li JS, Li DS, Wang ED*, Liu MF*.  piRNA-triggered MIWI ubiquitination and removal by APC/C in late spermatogenesis. Dev Cell, 2013, 24:13-25.

10. Qiao M, Zu LD, He XH, Shen RL, Wang QC, Liu MF*.  Onconase down-regulates microRNA expression through targeting microRNA precursors. Cell Res, 2012, 22:1199-202.

11. Jiang S, Zhang LF, ZhangHW, Hu S, Lu MH, Liang S, Li B, Li Y, Li D, Wang ED, Liu MF*. A novel miR-155/miR-143 cascade controls glycolysis by regulating hexokinase2 in breast cancer cells. EMBO J, 2012, 31:1985-1998.

12. Jiang S, Zhang HW, Lu MH, He XH, Li Y, Gu H, Liu MF*, Wang ED. MicroRNA-155 functions as an oncomiR in breast cancer by targeting the suppressor of cytokine signaling-1 gene. Cancer Res, 2010, 70: 3119-3127.

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