突破丨浙大郭国骥组Cell报道首个哺乳动物细胞图谱—汤富酬、刘兵点评

长久以来，生命科学的研究主要基于群体细胞水平的分析，而且对于难以获得大量研究材料的早期胚胎发育研究来说存在许多困难。近几年所涌现的单细胞组学技术，使我们能够从单细胞水平上更为精确的解析细胞的分化、再生、衰老以及病变。单细胞组学技术正在带来一场细胞检测、分类和鉴定的方法学革命，其应用范围从早期胚胎发育扩大到组织器官发育、血液系统、免疫和肿瘤等多个领域。

最近几年出现的用于高通量单细胞分子表达谱（high-throughput single-cell molecular profiling）的方法催生了科学共同体的一些共识，认为目前完成150年来鉴定人体所有细胞类型的努力的时机已经成熟，并提出了“人类细胞图谱计划”（“The Human Cell Atlas Project”），要对人体以及相关的模式动物所有的器官系统进行单细胞测序分析，鉴定出所有的细胞类型及其基因表达谱特征（下图）【1】。

浙江大学医学院的青年才俊、80后教授郭国骥博士从十年前的博士期间就开始了对单细胞组学的探索，其博士期间的代表性论文首次利用单细胞系统生物学的方法解析了小鼠的着床前胚胎发育全过程，论文中的单细胞数据聚类、降维、分群和拟时序分析等方法一直沿用至今【2】。在哈佛医学院博士后期间, 他对更为复杂的小鼠血液系统进行单细胞图谱的绘制工作【3】，并建立了新的造血干细胞分化模型。回国后其迅速组建团队并率先从单细胞水平上解析了小分子化合物组合诱导体细胞重编程的分子过程【4】，这似乎只是牛刀小试。

北京时间，2月23日凌晨，浙江大学医学院干细胞与再生医学中心郭国骥团队在Cell杂志上发表了题为“Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-seq”的研究论文，利用自主开发的一套完全国产化的Microwell-seq高通量单细胞测序平台，该团队对来自小鼠近50种器官和组织的40余万个细胞进行了系统性的单细胞转录组分析，并构建了首个哺乳动物细胞图谱。此外，在提升现有单细胞技术精确度的同时，该新技术的出现还使得单细胞测序文库的构建成本降低了一个数量级。可以说，该论文可称得上是单细胞组学领域里程碑式的研究成果。鉴于该成果的重大意义，BioArt特别邀请到了从事单细胞测序研究的北京大学汤富酬教授和军科院刘兵研究员做精彩点评，以飨读者！（温馨提示：文末有彩蛋！）

人体由200多种不同类型的细胞构成，每种细胞都有自己独特的基因表达特点。而且即使是同一类型的细胞，由于所处微环境以及基因表达机器的随机性也会呈现显著的细胞异质性（cellular heterogeneity）。

二代测序技术的发展，使得研究人员可以进行高通量、低成本的转录组测序分析，然而这种常规的RNA-Seq技术需要上万个细胞，而且所获得的结果是一个大细胞群体基因表达的均值，难以从单细胞水平弄清楚基因表达的异质性。由于测序技术的飞速发展与突破，研究人员目前可以使用高效、低廉的测序方法在单细胞水平对全基因组、转录组、DNA甲基化组等进行深入分析。值得一提的是，北京大学汤富酬教授在博后期间基于前人单细胞cDNA扩增的方法【5,6】首次报道了基于高通量测序的单细胞RNA-Seq技术，分析了来自小鼠四细胞胚胎阶段单个卵裂球的转录组【7】。

在最新的这项研究中，全面的涵盖了哺乳动物体内的各种主要细胞类型，并对每一种器官内的组织细胞亚型，基质细胞亚型，血管内皮细胞亚型，和免疫细胞亚型进行了详细的描述，绘制了一幅精美的“细胞地图”。研究发现来自于不同组织的基质细胞，拥有完全不同的基因表达特征，对组织特异性微环境行使重要的调节作用。同时该项工作构建了小鼠单细胞转录组数据库以及小鼠细胞图谱网站（http://bis.zju.edu.cn/MCA/）。该网站不仅拥有互动性的数据展示和基因搜索界面，还提供了强大的单细胞数据比对系统。任何单细胞表达谱数据都可以通过单细胞比对分析，寻找到它所对应的细胞类型和来源。这套系统将对细胞命运决定的机制性研究，再生医学的移植前细胞鉴定以及临床疾病的细胞水平诊断带来深远的影响。

郭国骥团队利用光刻技术制作了微孔矩阵硅片，先使用PDMS材料制作微柱矩阵模块，再利用琼脂糖大规模制备单细胞捕获用的微孔板。每个微孔板上大约有10万个微孔，能同时捕获约1万个单细胞。之后每个孔都会落入大小与孔径匹配的索引磁珠，给每个细胞的mRNA标记上特异的索引序列，然后构建混合测序文库并进行高通量测序，从而实现一次实验分析成千上万个单细胞的转录组。研究团队将该平台命名为Microwell-seq。

郭国骥团队所构建的Microwell-seq技术平台，操作简单、成本低廉，必将推动前沿单细胞测序技术在基础科研和临床诊断的普及和应用。同时小鼠细胞图谱的完成也将对下一步人类细胞图谱的构建带来指导性意义，并惠及细胞生物学、发育生物学、神经生物学、血液学和再生医学等多个领域。

郭国骥教授课题组成员

论文第一作者包括浙江大学医学院韩晓平博士，16级硕士生汪仁英，生科院16级博士生周银聪，医学院17级硕士生费丽江，17级直博生孙慧宇和15级博士生赖淑静。郭国骥研究员和韩晓平博士为本文共同通讯作者。

题外话：该论文的最后通讯作者（Lead Contact）为浙江大学医学院的80后教授、国家“青年千人”、国家“优青”郭国骥。熟悉他的朋友经常会调侃郭老师，说他明明可以进入娱乐圈当原创歌手，却偏偏把学术又做得这么好。细心的朋友可能会知道，郭老师在“中国原创音乐基地”有自己的主页（下图），该主页上有他早年创作录制的多首原创音乐，这里BioArt挑选了一首《当白羊爱上天蝎》，有兴趣的读者朋友可以点击欣赏。

郭国骥教授的原创音乐空间

郭国骥教授自弹自唱的另一面

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专家点评：

汤富酬（北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心教授，国家“杰青”）

Comments：细胞学说自从建立以来已经有160年的历史。研究人员很早就发现人体中至少有两百多种不同的细胞类型，每种细胞类型都有不同的基因表达特点。而且即使是同一种类型的细胞也因为细胞周期的不同、所处微环境的不同、以及基因表达机器的内在随机性而呈现出强烈的异质性（不均一性）。所以，理想的细胞基因表达调控的研究应该都是单细胞分辨率的研究。但是一个单细胞是非常微小的，通常哺乳动物的一个单细胞的直径只有0.01毫米（10微米）左右，其中含有的mRNA只有0.000001微克（1皮克）左右，对其进行全基因组水平的基因表达谱研究非常困难。因此过去几十年里基因表达谱研究基本上都是采用大量细胞进行系综平均分析，忽略了同一种细胞类型内部不同单细胞之间的异质性。2009年单细胞转录组高通量测序技术在国际上被首次建立以来，已经有二十多种不同的单细胞转录组测序技术被发展起来【7,8】。这些技术已经被用来对发育生物学和癌症生物学的很多系统进行了深入的研究，解决了很多重大的生物学问题。中国在单细胞测序领域处于国际领先地位，特别是以谢晓亮院士为代表的北京大学BIOPIC中心，在发展单细胞基因组测序、单细胞表观基因组测序、单细胞转录组测序、以及单细胞多组学平行测序技术体系方面取得了一系列国际领先的成就【9,10】。最近国际上提出了人类细胞图谱计划，要对人体内（以及相关的模式动物体内）所有的器官系统进行单细胞测序分析，鉴定出人体内（以及相关模式动物体内）所有的细胞类型及其基因表达谱特征【1】。这一计划相当于生物学领域的人类登月计划，意义重大，必将成为21世纪生物学研究的一个重要里程碑。中国在这方面应该也有国际领先的成绩，引领人类细胞图谱计划以及“单细胞基因组生物学”的发展。

浙江大学的郭国骥教授是单细胞测序领域的青年才俊，他今年才34岁。他于2014年回国组建自己的实验室，回国后短短的不到四年的时间里就取得了突破性成果，发展了基于微孔法的单细胞转录组测序新技术，并利用这一高通量、低成本、高灵敏度的技术对小鼠胚胎以及成体的不同器官系统的四十多万个细胞进行了单细胞转录组分析，相关成果发表在国际顶级生物学期刊《细胞》上【11】。国骥实验室分析了成体小鼠的主要组织器官-乳腺、子宫、膀胱、卵巢、肠道、肾脏、肺、精巢、胰腺、肝脏、脾脏、肌肉、胃、骨髓、胸腺、前列腺、外周血等。还分析了胚胎（14.5天）的各种主要组织器官。并以乳腺、肾脏、肺、胎盘等组织器官为例，详细讲述了其细胞类型组成及其生物学特点。更重要的是，他把不同组织器官中的基质细胞和驻留其中的免疫细胞的数据整合起来，进行了深入的全局分析，发现了这些细胞的共性规律以及组织特异性的个性规律。国骥实验室把所有这些发表的数据整合成使用界面友好的数据库，并放到其实验室网站上，供所有有兴趣的实验人员免费使用。更重要的是，如此丰富的单细胞转录组测序数据采用同一种技术、来自同一个实验室、有统一的质量控制标准，这是小鼠单细胞图谱测序数据的‘金矿’，必将为以小鼠为研究对象的发育生物学实验室提供巨大的帮助。

后续我相信国骥一定会把小鼠胚胎发育的所有主要阶段、以及成体小鼠体内的所有主要器官系统（不但包括野生型小鼠，也包括敲除各种关键基因的小鼠）都进行高通量的单细胞转录组测序（数千万个细胞的高精度单细胞转录组测序），最终建立完整的小鼠单细胞图谱。这将为国际上基于模式动物小鼠的发育生物学研究提供完整的“地图”和“路标”，必将全面引领“小鼠生物学”的未来发展。

刘兵（军事医学科学院研究员，国家“杰青”）

Comments：文章的题目尤为霸气！既突出了技术创新，也彰显了首个物种单细胞图谱的成功绘制！大约在200年前，人类认识到细胞是生命体的基本构造单元。今天，我们第一次真正得以目暏完整的小鼠细胞转录组图谱——40万个单细胞转录组图谱数据，涵盖51种组织和器官，定义了>800个细胞类型！海量的单细胞转录组数据，使得我们可以更加全面地从分子水平认识传统的基于组织形态学定义的细胞类型，有望重新定义和发现新的细胞类型。此外，这一宝贵数据值得进一步的深入挖掘，能够为许多以小鼠为模型的研究提供重要参考。尤为难得，这一成果的取得，得益于一个低成本大规模的单细胞测序技术——Microwell-seq。该技术由浙江大学郭国骥团队在国内独立完成，平均每个细胞0.02美元的文库制备价格，在目前所有测序方法中具有绝对优势。该技术在未来的发展及应用前景，大可期待！

参考文献：

1、Regev, A., Teichmann, S. A., Lander, E. S., Amit, I., Benoist, C., Birney, E., ... & Clevers, H. (2017). The human cell atlas. Elife, 6.

2、Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Sun, L. L., Clarke, N. D., & Robson, P. (2010). Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell, 18(4), 675-685.

3、Guo, G., Luc, S., Marco, E., Lin, T. W., Peng, C., Kerenyi, M. A., ... & Neff, T. (2013). Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell, 13(4), 492-505.

4、Han, X., Yu, H., Huang, D., Xu, Y., Saadatpour, A., Li, X., ... & Guo, G.. (2017). A molecular roadmap for induced multi-lineage trans-differentiation of fibroblasts by chemical combinations. Cell research, 27(3), 386.

5、Kurimoto, K. et al. An improved single-cell cDNA amplification method for efficient high-density oligonucleotide microarray analysis. Nucleic Acids Res. 34, e42 (2006).

6、Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y. & Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nat. Protoc. 2, 739–752 (2007).

7、Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N, Wang X, Bodeau J, Tuch BB, Siddiqui A, Lao K, Surani MA. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 2009 May;6(5):377-82.

8、Wen L, Tang F. Single-cell sequencing in stem cell biology. Genome Biology. 2016 Apr 15;17:71.

9. Huang L, Ma F, Chapman A, Lu S, Xie XS. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102.

10. Wen L, Tang F. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 2018 Feb;59:62-69. doi: 10.1016/j.mam.2017.09.002.

11. Han X, Wang R, Zhou Y, Fei L, Sun H, Lai S, Saadatpour A, Zhou Z, Chen H, Ye F, Huang D, Xu Y, Huang W, Jiang M, Jiang X, Mao J, Chen Y, Lu C, Xie J, Fang Q, Wang Y, Yue R, Li T, Huang H, Orkin SH, Yuan GC, Chen M, Guo G. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-seq. Cell

附通讯作者简介：

郭国骥，浙江大学医学院教授，博士生导师，浙江大学医学院干细胞与再生医学中心副主任，浙江大学干细胞联盟副主席。2005年本科毕业于武汉大学。2010年毕业于新加坡国立大学，获得理学博士学位。之后赴美国哈佛大学医学院从事博士后研究工作，任达纳法伯癌症中心及波士顿儿童医院Research Fellow。2014年入职浙江大学医学院。2015年入选“国家青年千人计划”，2016年获“浙江省杰出青年基金”，2017年获“国家优秀青年基金”。现任中国生理学会血液生理学专业委员会青年委员；浙江省转化医学会干细胞与再生医学分会委员。其主要利用单细胞分析技术研究干细胞的再生和分化机制，并在胚胎干细胞和成体干细胞领域有突出贡献。以通讯作者和第一作者身份在Cell, Cell Stem Cell, Cell Research, Developmental Cell等著名期刊发表多篇学术论文。

韩晓平，浙江大学医学院副教授。2007年本科毕业于南开大学，2012年在中国农业大学获得博士学位（2009.12—2011.6，新加坡基因组研究院联合培养博士），2013年-2014年在哈佛医学院任研究助理，2014年12月任职浙江大学医学院至今。目前以第一作者或通讯作者在包括Cell、Cell Research、Cell Reports等杂志发表研究论文多篇。

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