Cell丨李毓龙组开发新型多巴胺荧光探针——仇子龙点评

责编丨刘志睿

点评丨仇子龙

多巴胺（DA）是神经系统中关键的单胺类神经递质。在多种脊椎动物中枢神经系统中，DA广泛调节了许多复杂的生理功能，包括学习【1】、奖赏【2，3】、注意力【4】和运动控制【5】等。 在人类大脑中，DA传递受损与多种神经系统疾病有关，包括多动症【6】、精神分裂症【7】、帕金森氏病【8】等。此外，可卡因等精神兴奋剂通过改变大脑中的细胞外DA水平来发挥成瘾作用【9-12】。

尽管DA具有这些重要作用，但是仍缺乏在复杂行为期间对DA释放的精确测量，这在很大程度上归因于现有DA检测方法的局限性。脑内微透析长期以来一直是细胞外DA浓度定量测量的金标准。然而，其相对较慢的采样率（两次采样之间间隔 > 1分钟，通常约为10分钟），制约了在复杂和快速演变的行为中检测DA动态变化。快速扫描循环伏安法（FSCV，Fast-scan cyclic voltammetry）是一种电化学方法，可以测量细胞外DA浓度的变化，具有10毫秒的时间分辨率和约1 nM的灵敏度。然而，FSCV需要基板氧化来进行信号检测；因此，这种方法不能有效区分DA与其他结构相似的神经递质，例如去甲肾上腺素（NE）。此外，微透析和FSCV法都需要将相对较大的探针（直径约70-300 mm）植入脑组织，这限制了实现精确测量内源性DA释放的能力。

有别于直接测量，目前已经发展出使用间接方法（例如测量DA受体的下游靶标的激活）来近似测量DA的动态变化。基于细胞的DA报告基因，例如CNiFERs使用内源性表达DA受体的HEK293细胞和细胞内Ca2 +指示剂将细胞外DA信号强度与细胞的荧光变化偶联。尽管这种具有高灵敏度，但需要借助细胞移植的技术，并且仅能报告囊泡内DA的传递。 TANGO技术以及它的下一代改良技术通过偶联β-arrestin信号通路测量内源性DA释放。尽管该方法能够使细胞类型特异地测量DA报告基因并且适合于体内测量，但是长信号放大时间（大约数小时）无法动态快速地对DA信号传导进行实施测量。

为更好地研究多巴胺在生理和病理过程中起到的作用，研究人员需要实时检测活体内特定脑区的多巴胺信号变化，然而现有的检测手段并不能满足研究人员的需求。7月12日，Cell在线报道了北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心、PKU-IDG/麦戈文脑科学研究所李毓龙研究组题为A genetically-encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice的研究论文。该研究中开发了一系列同时具有直接、快速、高敏感度和细胞类型特异性检测的新型DA荧光探针传感器，并将其应用在果蝇、斑马鱼和小鼠中检测内源多巴胺动态变化，该探针将成为研究多巴胺相关神经环路的重要工具。

这些传感器，被称之为GRABDA（GPCR-activation-based-DA，基于G蛋白偶联受体- 活化的DA传感器)。研究组通过将对结构变化敏感的荧光蛋白（cpEGFP）嵌入人源多巴胺受体，使多巴胺这一化学信号转化为荧光信号，结合现有的成像技术，即可实时监测多巴胺浓度的动态变化情况。通过反复的基因工程和优化实验，得到了两个GRABDA传感器适用于多巴胺释放量不同的脑区：一个是对DA具有中等半数效应浓度（约130 nM）的GRABDA1m（缩写为DA1m），和一个对DA具有高半数效应浓度（约10 nM）的GRABDA1h（缩写为DA1h）。这两种传感器能够实时检测小鼠急性脑切片中的内源性DA含量，以及多种动物模型的完整大脑的DA，包括苍蝇、鱼和小鼠，适用于多巴胺释放量不同的脑区。

由于开发出的探针具有可基因编码的特性，李毓龙研究组通过转染、病毒注射以及构建转基因动物等手段，将探针表达在细胞、小鼠脑片或者活体果蝇、斑马鱼、小鼠中。实验结果表明，长时间表达该探针对模式生物的生长状态无明显影响。利用该探针，他们检测到了电刺激小鼠脑片引发的多巴胺释放，并在活体果蝇、斑马鱼和小鼠的大脑中检测到了与嗅觉刺激、视觉刺激、学习记忆、交配行为相关的多巴胺信号变化。该探针将成为研究多巴胺相关神经环路的重要工具。

特别值得一提的是，3天前李毓龙研究组在Nature Biotechnology在线发表的乙酰胆碱探针与本文中的多巴胺探针有着相似的工作原理（NBT | 北大李毓龙组开发新型乙酰胆碱荧光探针——专家点评）。两者都是基于人源神经递质受体，将神经递质结合受体所引发的受体构象变化转化为荧光信号的变化，这说明此发展策略具有可推广性。这两项工作为今后大规模开发其他神经递质、神经调质探针奠定了扎实的研究基础。除此之外，前不久李毓龙组还在Current opinion in neurobiology杂志上发表综述文章专门讨论了用于检测神经递质的可遗传编码的荧光探针，并提到了基于G蛋白偶联受体的传感器的潜在应用。

北京大学生命科学学院李毓龙研究员为本文的通讯作者。李毓龙研究组博士生孙芳妙、曾健智、井淼为共同第一作者；冯杰思、骆奕辰、雍自昊、王欢为此项研究成果做出了重要贡献。

专家点评

仇子龙（中科院神经科学研究所研究员，国家“杰青” ）

第一次见到李毓龙，是在2009年4月的美国冷泉港学术会议，很难让人不注意到这么一个在每次报告后都会提问的年轻人。那时候我知道他是著名科学家钱永佑（Richard Tsien）的博士后，他对脑科学的很多领域都非常感兴趣，对每个报告都要思考一番，然后提问。

后来很高兴得知毓龙全家喜归母校北大，也知道他开辟了全新领域的研究，选择了一个与博后导师钱永佑教授完全不一样的方向，建立遗传编码探针的方法去探究神经化学递质的体内定量化测量与标记。有趣的是，这个方向让我想起了他导师的弟弟，著名科学家，诺贝尔化学奖获得者钱永健（Roger Tsien）。当我在UCSD做博士后的时候，经常看见钱永健教授在每次学术会议上，认真聆听，积极提问的身影。钱永健教授是学化学出身的，但是对神经科学的方方面面都非常感兴趣，也建立了一系列对整个生物学界都非常重要的绿色荧光蛋白探针与感受电压变化的化学探针等等，也因此获得了诺贝尔化学奖。遗憾的是，钱永健教授几年前离我们而去了。

让我们高兴的是李毓龙教授，仿佛举起了钱永健教授的火炬，肩负着钱永健与钱永佑两位著名科学家的信念，带给我们了一个又一个重要的分子探针。李毓龙教授在这个星期发表的两篇重要文章，分别建立了遗传编码的乙酰胆碱与多巴胺递质的分子探针，这两个重要工作堪称是划时代的贡献，将重塑神经科学的研究图景。

在李毓龙教授的工作之前，我们只能研究某种神经元的电活动活性，却无法知道我们的大脑释放的各种化学递质在体内究竟有多少？在各种生理活动的时候，神经化学递质的释放究竟如何实时做出反应？李毓龙教授的工作便让我们能够从此将化学递质的研究走进脑内在体研究与定量化研究的范畴。非常值得一提的是，李毓龙教授的这两篇文章都与许多同行开展了广泛的合作，分别在多种模式生物中验证了新型分子探针的灵敏性与可靠性，这些同行的慷慨合作让毓龙教授可以将分子探针这把利剑越磨越锋利。让我们期待李毓龙教授继续为我们带来更多的惊喜，在北大做出更精彩的工作！

参考文献

1. Holroyd, C. B. & Coles, M. G. H. The neural basis of human error processing: reinforcement learning, dopamine, and the error-related negativity. Psychol Rev 109, 679-709, doi:10.1037/0033-295X.109.4.679 (2002).

2. Schultz, W. Dopamine reward prediction-error signalling: a two-component response. Nature Reviews Neuroscience 17, 183 (2016).

3. Wise, R. A. Dopamine, learning and motivation. Nature reviews neuroscience 5, 483 (2004).

4. Nieoullon, A. Dopamine and the regulation of cognition and attention. Progress in neurobiology 67, 53-83 (2002).

5. Graybiel, A. M., Aosaki, T., Flaherty, A. W. & Kimura, M. The basal ganglia and adaptive motor control. Science 265, 1826-1831 (1994).

6. Cook Jr, E. H. et al. Association of attention-deficit disorder and the dopamine transporter gene. American journal of human genetics 56, 993 (1995).

7. Howes, O. D. & Kapur, S. The dopamine hypothesis of schizophrenia: version III—the final common pathway. Schizophrenia bulletin 35, 549-562 (2009).

8. Lotharius, J. & Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience 3, 932 (2002).

9. Ritz, M. C., Lamb, R. & Kuhar, M. Cocaine receptors on dopamine transporters are related to self-administration of cocaine. Science 237, 1219-1223 (1987).

10. Di Chiara, G. & Imperato, A. Drugs abused by humans preferentially increase synaptic dopamine concentrations in the mesolimbic system of freely moving rats. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 5274-5278 (1988).

11. Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M. & Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature 379, 606-612, doi:10.1038/379606a0 (1996).

12. Hernandez, L. & Hoebel, B. G. Food reward and cocaine increase extracellular dopamine in the nucleus accumbens as measured by microdialysis. Life sciences 42, 1705-1712 (1988).

13. Wang, H., Jing, M., & Li, Y. (2018). Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current opinion in neurobiology, 50, 171-178.

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