Nature背靠背 | 阮建彬课题组揭示GSDMB 成孔机制及病原体逃逸天然免疫的分子机制

撰文 | Wonderful

细胞焦亡（Pyroptosis）是一种炎症性细胞死亡，与宿主天然免疫以及肿瘤免疫治疗密切相关【1】。近期研究发现，当细菌、病毒等病原体引发胞内感染时，炎症小体信号通路会被激活，最终酶切活化成孔蛋白Gasdermin (GSDM) D，释放具有成孔活性的N端结构域。GSDMD N-端结构域通过在细胞膜上寡聚成孔，引起细胞破裂，导致细胞焦亡及胞质内溶物释放，进而诱发强烈的炎症反应，达到消灭病原体或清除内源性有害因子的目的【1】。随后，GSDM家族其他蛋白（GSDMA–E）介导细胞焦亡的现象被陆续发现。由于GSDM蛋白的活化不仅仅依赖于于炎症性Caspase，细胞焦亡也被重新定义为GSDM介导的可调控细胞死亡【2】。值得一提的是，在GSDM家族中，人源GSDMB包含6种剪接体，而在啮齿类动物中不包含同源蛋白。

目前针对GSDMB的研究，存在一些主要的问题。其中GSDMB是否介导细胞焦亡是该领域最有争议的问题之一。邵峰院士课题组发现细胞毒性淋巴细胞（如NK， CTLs细胞等）中的丝氨酸蛋白酶Granzyme A可以经穿孔素（perforin）进入靶细胞，通过水解GSDMB诱导靶细胞发生焦亡（邵峰组Science报道细胞毒性淋巴细胞诱导细胞焦亡的机制）【3】。而近期两项研究发现GSDMB并不能介导宿主细胞焦亡（Cell | Gasdermins家族蛋白不依赖于焦亡的新作用：肠道健康与修复；Cell | “道高一尺，魔高一丈”：福氏志贺菌已发展出泛素化降解GSDMB的策略来抵抗NK细胞的杀伤作用）【4,5】。相反，GSDMB能够识别革兰氏阴性细胞膜，在细菌表面成孔并杀死细菌。有趣的是，为了应对GSDMB介导的杀菌作用，志贺氏菌通过其T3SS分泌系统释放效应分子IpaH7.8–一种E3泛素连接酶，泛素化GSDMB使其被26S蛋白酶体降解，从而免于被NK细胞杀死【4】。IpaH7.8同样可以泛素化人源GSDMD，进而引发GSDMD的降解，阻断GSDMD介导的细胞焦亡发生，起到逃避宿主防御机制。令人惊讶的是，IpaH7.8不能泛素化鼠源GSDMD，导致小鼠体内的志贺氏菌能被快速清楚【6】。这或许解释了人类和非人类灵长类动物是志贺氏菌的天然宿主，而小鼠却不是。目前，GSDMB以及人源GSDMD如何被IpaH7.8特异性识别及泛素化的分子机制仍然未知。

2023年3月29日，康涅狄格大学健康中心免疫系阮建彬教授课题组（第一作者为汪成亮博士）在Nature杂志上发表文章 Structural basis for GSDMB pore formation and its targeting by IpaH7.8 。本研究报道了人源GSDMB与志贺氏菌IpaH7.8复合物以及GSDMB孔复合物的冷冻电镜结构。其中，GSDMB孔复合物结构揭示了GSDMB不同剪接体具有不同成孔活性的分子机制；GSDMB-IpaH7.8复合物结构阐明了志贺氏菌IpaH7.8识别GSDMB结构机理并解释了IpaH7.8识别人源GSDMD而非鼠源GSDMD的分子机制。

为了探讨IpaH7.8特异性识别GSDMs的分子机制，作者解析了志贺氏菌 E3泛素化连接酶IpaH7.8与GSDMB复合物的冷冻电镜结构（图1a）。结构表明IpaH7.8通过LRR（Leucine-rich repeat）结构域与GSDMB的N端结构域结合。二者主要包含两个相互作用界面：界面一是由IpaH7.8的LRR motif 7-9与GSDMB的α1–β1’ 之间的柔性区构成；界面二是由IpaH7.8的LRR motif 4-6 与GSDMB的 β3折叠片构成（图1b,c）。

GSDMB中与IpaH7.8相互作用的α1–β1’柔性区含有三个负电荷性质的氨基酸，是IpaH7.8识别的关键因素。该柔性区在人源GSDMD中保守；而鼠源GSDMD中第17位氨基酸为丝氨酸，同时存在一个第20位的精氨酸插入，导致参与相互作用的D₂₂远离了IpaH7.8的作用界面，从而导致鼠源GSDMD不能被IpaH7.8识别（图1b，d）。

GSDMB中参与IpaH7.8相互作用的另一个结构元件β3折叠片与GSDM成孔时跨膜区的形成有关。IpaH7.8的结合有可能直接抑制GSDMB的成孔。生物化学分析显示，随着IpaH7.8的加入，GSDMB成孔后介导的脂质体破裂现象被明显抑制；此外，IpaH7.8的加入也明显减弱了GSDMB的杀菌能力（图1e）。

对GSDMD的研究表明，IpaH7.8对GSDMD介导细胞焦亡的抑制依赖于蛋白酶体对泛素化GSDMD的降解。泛素化本身并不抑制GSDMD的活性【6】。在本研究中，作者发现泛素化的GSDMB几乎丧失了结合脂质体及成孔的能力。通过与GSDMD的结构比较，作者发现GSDMB含有数个与GSDMD在结构并不保守的潜在泛素化赖氨酸位点。这些赖氨酸位点主要分布在GSDMB孔寡聚界面、磷脂结合界面及跨膜区上（图1f）。通过定点突变， 作者鉴定出了位于GSDMB跨膜区能够被IpaH7.8泛素化修饰的K177, K190 和 K192位点（图1g）。

图1：IpaH7.8识别GSDMB结构机理

前文提到，人源GSDMB存在至少6种剪接体。其中剪接体5仅包含C端结构域，其他剪接体具有保守的N端和C端结构域，而两个结构域之间的链接区域具有不同的长度和序列（图2a）。推测链接区域可能介导了对GSDMB成孔活性的调控。实验表明，GSDMB剪接体4和6能够明显导致细胞焦亡，而剪接体1、2和3则不具备这种活性（图2b）。

为了进一步阐明链接区域调控GSDMB成孔活性的分子机制，作者制备了GSDMB剪接体1,4,6孔复合物的电镜样品，选取其中性质较好的剪接体1的孔复合物，并解析了其冷冻电镜结构（图2c）。GSDMB孔复合物由24-26个亚基组成，其成孔机制与GSDMA3和GSDMD高度相似【7,8】。

通过对GSDMB孔复合物结构中链接区域的结构分析，作者发现该链接区域同时参与了孔复合物寡的聚化以及与细胞膜磷脂的相互作用。链接区域的前半部分（Region I）参与到孔复合物中亚基间的相互作用，当该段区域发生突变时，GSDMB不再具备成孔活性（图2d）。而链接区域的后半部分（Region II）则直接与细胞膜表面带负电的磷脂分子结合。在GSDMB剪接体4和6中，该段区域包含了R225/K227/K229三个碱性氨基酸，与细胞膜具有较强的结合能力，因而表现出较强的成孔活性；而在GSDMB剪接体1中，由于链接区域前端四个额外的氨基酸插入，导致与细胞膜的界面被局部破坏，致使剪接体1的成孔活性大大减弱；而剪接体2和3由于Region I和II的完全缺失，导致其完全丧失成孔的能力（图2e-g）。

图2：GSDMB细胞焦亡活性调控的分子机制

综上所述，该项研究发现了调控GSDMB焦亡活性的结构性因素，在原子层面回答了GSDMB介导细胞焦亡这一争议性问题；同时揭示了志贺氏菌IpaH7.8识别特定GSDMs的分子机制。

值得一提的是，同期Nature杂志刊登了中科院生物物理研究所丁璟珒课题组和北京生命科学研究所邵峰团队在线发表题为“Structural mechanisms for regulations of GSDMB pore-forming activity”的合作研究论文，揭示了IpaH7.8特异性识别GSDMB和GSDMD两种焦亡蛋白的结构基础，破解了GSDMB可变剪接调控细胞焦亡活性的精确分子机理。

康涅狄格大学健康中心免疫系阮建彬教授为本文的通讯作者，汪成亮博士为论文的第一作者，课题组成员田甜博士，Vijay A. Rathinam教授及其课题组成员Sonia Shivcharan博士、博士生Skylar Wright也参与了课题工作；特别感谢Quintarabio公司窦双博士的大力帮助。

康涅狄格大学健康中心阮建彬教授课题组简介

阮建彬教授课题组一直围绕天然免疫信号通路以及病原体引起的免疫应答分子机制进行研究，旨在为相关感染性疾病譬如脓毒症（Sepsis）、癌症及自身免疫性疾病等探索新的药物靶点，提供新的治疗策略。阮建彬博士在天然免疫领域取得一系列原创性成果，发表高水平研究论文30余篇，其中以第一或通讯作者在Nature、Cell、EMBO Journal等杂质发表发表论文10余篇，以共同作者在Nature、Science、Cell、Nature Immunology等杂志发表论文20余篇，他引6000余次。课题组期待有理想、有兴趣的研究生或者博士加入这支年轻、敢于挑战的团队。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-023-05832-z

https://doi.org/10.1038/s41586-023-05872-5

制版人：十一

参考文献

1 Broz, P., Pelegrin, P. & Shao, F. The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation. Nat Rev Immunol 20, 143-157, doi:10.1038/s41577-019-0228-2 (2020).

2 Galluzzi, L. et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ 25, 486-541, doi:10.1038/s41418-017-0012-4 (2018).

3 Zhou, Z. et al. Granzyme A from cytotoxic lymphocytes cleaves GSDMB to trigger pyroptosis in target cells. Science 368, doi:10.1126/science.aaz7548 (2020).

4. Hansen, J. M. et al. Pathogenic ubiquitination of GSDMB inhibits NK cell bactericidal functions. Cell 184, 3178-3191 e3118, doi:10.1016/j.cell.2021.04.036 (2021).

5. Rana, N. et al. GSDMB is increased in IBD and regulates epithelial restitution/repair independent of pyroptosis. Cell 185, 283-298.e17, doi.org/10.1016/j.cell.2021.12.024 (2022).

6. Luchetti, G. et al. Shigella ubiquitin ligase IpaH7.8 targets gasdermin D for degradation to prevent pyroptosis and enable infection. Cell Host Microbe 29, 1521-1530 e1510, doi:10.1016/j.chom.2021.08.010 (2021).

7. Ruan, J., Xia, S., Liu, X., Lieberman, J. & Wu, H. Cryo-EM structure of the gasdermin A3 membrane pore. Nature 557, 62-67, doi:10.1038/s41586-018-0058-6 (2018).

8. Xia, S. et al. Gasdermin D pore structure reveals preferential release of mature interleukin-1. Nature 593, 607-611, doi:10.1038/s41586-021-03478-3 (2021).

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