Mol Cell | 乔云波/王升启/刘真合作开发新型细胞核和线粒体DNA胞嘧啶碱基编辑器

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大多数真核生物的细胞核及半自主性细胞器，包括线粒体等均具有遗传物质DNA，并且细胞核DNA (nDNA) 和线粒体DNA (mtDNA) 突变会导致多种疾病的发生。为了探究核基因突变相关疾病的致病机理和治疗策略，研究人员针对nDNA开发了基于CRISPR的单碱基编辑（与单链DNA脱氨酶融合）和先导编辑系统（与逆转录酶融合）。然而，目前将RNA递送至线粒体内依然是巨大挑战，因此基于CRISPR系统的单碱基编辑和先导编辑策略在mtDNA中难以实现。

为了解决此难题，2020年Dr. David Liu团队开发了DdCBE【1】，将伯克氏菌  (Burkholderia cenocepacia) 来源的具有双链DNA胞嘧啶脱氨酶活性的毒素样蛋白 (DddA_tox；由于全长毒素样蛋白具有细胞毒性，将其分割为DddA_tox-N 和DddA_tox-C 两部分)，分别与带有线粒体定位信号序列（MTS）和识别靶位点的TALE（转录激活因子(TAL)效应子；包括识别左臂的left side TALE(TALE-L)和识别右臂的right side TALE (TALE-R)）进行融合，充分利用TALE的靶向活性和DddA_tox的不依赖于解旋的双链DNA脱氨酶活性，从而实现了mtDNA靶向位点的高效C-to-T编辑。然而，DdCBE对靶位点的DNA序列有一定要求，主要发生在5’-TC序列中（即靶向胞嘧啶5’端偏好“T”），序列偏好性极大限制了DdCBE的应用范围。该团队利用噬菌体辅助进化系统在DddA_tox中引入突变，获得其突变体DddA11【2】，实现了5’-HC (H=A, C, T)序列中的C-to-T编辑，然而对5’-GC依然难以实现有效编辑。

2023年5月3日，上海交通大学医学院附属第九人民医院上海精准医学研究院乔云波课题组、军事医学研究院王升启课题组、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心刘真课题组合作在Molecular Cell发表题为A DddA ortholog-based and transactivator-assisted nuclear and mitochondrial cytosine base editors with expanded target compatibility的研究论文。研究人员从DddA_tox同源物中成功筛选到一种新型双链DNA脱氨酶，该酶源自一种肠道菌毒素(Roseburia intestinalis；命名为riDddA_tox)。随后，他们使用riDddA_tox成功开发了CRISPR系统介导的核基因胞嘧啶碱基编辑器crDdCBE和TALE系统介导的线粒体基因胞嘧啶碱基编辑器 (mitoCBE)，分别在核基因和线粒体基因实现了高效的双链DNA编辑；与最近报道的DddA11相比，riDddA_tox介导的mitoCBE完全克服了DNA序列限制。

为了更进一步提高crDdCBE和mitoCBE的编辑效率，研究人员通过一系列工程化手段，开发了一种潜在的可提高编辑效率的通用策略【3】，即在编辑器C-末端融合转录激活元件(VP64、P65、Rta)，可显著提高DdCBE和我们开发的crDdCBE、mitoCBE的靶向编辑效率，在一些本身编辑效率极低或无效位点可通过融合转录激活元件实现“从无到有”的编辑效果；其中，Rta的辅助提升编辑效果最为显著，将其命名为mitoCBE2.1。最后，在人类和小鼠细胞系、小鼠早期胚胎中，利用mitoCBE2.1实现高效精准引入人类疾病相关的mtDNA突变。此外，研究人员发现该类双链DNA脱氨酶基本不会产生RNA脱靶编辑活性，并且系统评估了riDddA_tox介导的mitoCBE的线粒体基因组和全基因组脱靶活性，发现其线粒体DNA脱靶活性略高于DdCBE，而核基因脱靶活性相当。值得一提的是，在本工作修稿期间，北京大学汪阳明教授课题组报道了另外一个来源于思邈菌（Simiaoa Sunni）的双链DNA脱氨酶，亦实现了线粒体基因组的无序列限制性高效编辑【4】。这说明，自然界可能存在多种编辑特性和毒蛋白特性的双链DNA脱氨酶，有待进一步开发和应用。

本研究开发的基于riDddA_tox的crDdCBE和mitoCBE显著提高了核基因/线粒体基因组的靶向效率和序列兼容性，拓宽了疾病建模和基因组工程化改造的普适性，而转录激活元件融合提升编辑效率的发现也可能扩展到其它应用。然而，线粒体碱基编辑器的旁侧编辑、核基因/线粒体基因脱靶等问题，还有待于研究人员进一步解决，以推动其应用于线粒体DNA突变相关的疾病动物模型构建、疾病模拟和治疗等。本研究得到南京医科大学沈彬教授等的大力支持。

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附：

乔云波，上海交通大学医学院附属第九人民医院上海精准医学研究院，研究员。主要研究方向：利用CRISPR、TALEN等系统，开发精准、高效的细胞核和线粒体基因编辑工具，构建遗传类疾病模型。在此基础上，利用基因编辑工具（碱基编辑和先导编辑），结合表观遗传学手段和高通量测序技术，高通量解析表观遗传修饰及其关联因素在生殖发育、干细胞命运决定和人类重大疾病（主要为肿瘤）中的功能和调控机制。目前，在Mol Cell, Cell Research（2篇）, Advanced Science, Nature Communications（3篇）, Molecular Therapy, Cell Reports等学术期刊发表论文20余篇，获授权国家发明专利3项。因课题组发展需要，现诚聘博士后和助理研究员若干名，待遇优厚，热烈欢迎对基因编辑和表观遗传领域感兴趣的青年才俊加入。

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原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.04.012

制版人：十一

参考文献

1. Mok, B.Y., de Moraes, M.H., Zeng, J., Bosch, D.E., Kotrys, A.V., Raguram, A., Hsu, F., Radey, M.C., Peterson, S.B., Mootha, V.K., et al. (2020). A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature 583, 631-637. 10.1038/s41586-020-2477-4.

2. Mok, B.Y., Kotrys, A.V., Raguram, A., Huang, T.P., Mootha, V.K., and Liu, D.R. (2022). CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA. Nat Biotechnol. 10.1038/s41587-022-01256-8.

3. Liu, G., Yin, K., Zhang, Q., Gao, C., and Qiu, J.L. (2019). Modulating chromatin accessibility by transactivation and targeting proximal dsgRNAs enhances Cas9 editing efficiency in vivo. Genome Biol 20, 145. 10.1186/s13059-019-1762-8.

4. Mi, L., Shi, M., Li, Y.X., Xie, G., Rao, X., Wu, D., Cheng, A., Niu, M., Xu, F., Yu, Y., et al. (2023). DddA homolog search and engineering expand sequence compatibility of mitochondrial base editing. Nat Commun 14, 874. 10.1038/s41467-023-36600-2.

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