拯救你的免疫组化实验 你需要了解这些
前言
免疫组织化学技术，又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，利用抗原－抗体特异性结合的原理通过化学反应使标记抗体的显色剂显色以确定细胞内抗原，以此对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行定位、定性及定量的研究。
如今, 免疫组织化学染色技术不仅在科研实验过程中被广泛应用，而且也是肿瘤病理诊断中重要的辅助手段, 下面就让我们了解下免疫组化染色过程及容易出现的一些问题。
发展简史
1. 1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
2. 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。
3. 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
4. 80年代 Hsu 等建立了卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法之后，免疫金银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
5. 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。
6. 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的 一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。
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免疫组织化学（IHC）分类
（1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
（2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
（3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等；聚合物链接，如即用型二步法，该方法很适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。
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IHC基本流程
1.脱蜡与水化
脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他试剂能够在亲水环境下充分与组织中抗原等物质发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，产生组织着色不均或不着色的情况。2. 阻断
用0.3%~3%过氧化氢水溶液或甲醇溶液孵育5分钟-30分钟，以过量反应底物使酶反应失活从而阻断内源性过氧化物酶的影响。3. 抗原修复
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
抗原修复的主要方法:
常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。
常用的修复溶液和试剂为Tris-EDTA（pH 9.0）、柠檬酸缓冲液（pH 6.0）、胰酶、胃蛋白酶。
4.封闭非特异性蛋白位点
封闭血清一般是和二抗同一来源的健康非免疫动物血清，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，从而减少二抗与这些位点的结合。5. 一抗孵育
一抗:可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的目标抗原。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。 在抗原抗体反应中，抗体的选择至关重要。一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较弱；而多克隆抗体亲和力强，灵敏度高，但特异性稍弱，易出现非特异性染色。（Tip： 华安生物的重组兔单抗是个不错的选择，不仅抗体特异性强，而且亲和力也高，绝对是免疫组化实验中的强大助力。）另外，一抗孵育条件也很重要，包括孵育时间和抗体浓度。常用的孵育条件有三种：4℃孵育过夜、37℃孵育0.5~1h和室温孵育1h。其中4℃孵育过夜通常是最佳的孵育条件。6. 二抗孵育
二抗可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。7. 显色
在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于标记的显色剂的显色作用，常用的是辣根过氧化物酶（DAB显色），DAB会产生棕色沉淀，该棕色沉淀不溶于水和乙醇，化学性质稳定，有利于显微镜下观察和切片的保存。8. 复染、脱水、透明、封片
免疫组化的复染是衬染，目的在于标记细胞便于观察和定位，细胞核的着色要浅于HE染色，过深的复染会干扰核定位着色的观察，常用的复染试剂为Mayer's苏木素和Harry's苏木素。常见问题分析
1. 假阴性
原因分析：
（1）确认是否漏加或错加试剂；
（2）确认是否使用了正确的抗体及稀释度；
（3）检查抗体的有效期和保存条件；
（4）检查标本的储存条件，设置阳性对照；
（5）检查色原/底物溶液是否正确；
（6）检查复染剂和封片剂和所使用的显色剂是否匹配；
（7）检查抗原处理方式是否正确，有些不正确的处理方式会破坏染色。
人胃腺癌组织GDF15 IHC检测 EDTA微波修复
2. 弱阳性
原因分析：
（1）标本的固定方式；
（2）不当的烤片温度及时间；
（3）不适当的抗原修复方式；
（4）抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确；
（5）切片上遗留了过多的缓冲液，二次稀释了抗体；
（6）孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
食管癌组织p-STAT3 IHC检测
EDTA微波修复
食管癌组织p-STAT3 IHC检测
柠檬酸高压修复
3. 非特异性染色
原因分析：
（1）是否有效地去除了内源性生物素，过氧化物酶；
（2）是否选择使用了正确的封闭血清；
（3）所选择的抗体是否符合试验要求；
（4）一抗的使用浓度是否过高；
（5）清洗是否充分。溶液内加入吐温20，效果更佳；
（6）标本染色过程中是否干片，抗体不能完全覆盖组织会引起边缘效应；
（7）检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有 交叉反应。
鼠大肠 PCNA抗体IHC 未进行内源性阻断
鼠大肠 PCNA抗体IHC 进行内源性阻断
4. 假阳性
原因分析：
（1）自发荧光或内源酶干扰；
（2）抗体试剂不纯，特别是一抗；
（3）修复过强；
（4）少数组织变异或反常表达。
小鼠肾EGFR IHC检测
柠檬酸高压修复
（鼠兔通用二抗）
阴性对照
免疫组织化学技术操作要点较多，总之，熟悉操作原理，严格按照操作步骤进行操作，了解实验中可能出现的各种问题及解决方法，完全可以得到理想的免疫组化检测结果。
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关于华安
杭州华安生物技术有限公司成立于2007年，总部位于中国杭州；2017年在美国波士顿成立全资控股子公司：HUABIO INC. 。华安生物致力于为全球的科研工作者和工业客户提供高品质的抗体试剂及抗体服务。 公司的产品线包括单抗、多抗、二抗、蛋白/多肽、抗体检测用试剂等4000余种。同时，公司也为客户提供定制抗体的开发、纯化和筛选服务。
迄今为止，公司已累计完成超过 3000个定制科研抗体项目，为工业级客户开发IVD诊断用肿瘤标志物系列抗体原料和食品安全检测相关抗体几十余种，为制药公司提供包括PD1和PD-L1热门靶点在内的早期抗体药物筛选十余种。
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