GAP43，一种新型非小细胞肺癌转移启动子
近期刊发在《Journal of Translational Medicine》杂志上的一篇题为“GAP43, a novel metastasis promoter in non‑smallcell lung cancer”的文章揭示了非小细胞肺癌中一种新型转移启动子，文章通讯作者为浙江省肿瘤医院苏丹教授。
研究
背景
在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，脑转移是极其严重的后遗症，会导致预后不佳。脑转移是最严重的晚期恶性肿瘤后遗症之一。 大约20-30％的非小细胞肺癌（NSCLC）患者在疾病过程中发生脑转移，10-20％的患者同时诊断为脑转移和原发肿瘤。 由于颅外疾病的控制能力增强以及磁共振成像的广泛应用，预计未来几年NSCLC脑转移患者的比例将会增加。 脑转移的治疗和结果仍然不能令人满意，尽管目前，可以向一些EGFR突变或ALK重排的NSCLC患者提供适当的靶向治疗。 因此，探索识别潜在治疗靶标的潜在机制是有价值的。
最近，越来越多的研究集中于器官特异性转移。成功的脑转移细胞需要特殊的机制来穿过血脑屏障（BBB），这是一种由脑血管内皮细胞形成的选择性屏障，它对脑微环境起着最重要的控制作用。据报道，在脑血管分支处停留的肿瘤细胞可以粘附到内皮并分泌某些细胞因子，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），以打破紧密连接和促进内皮单层的收缩。伴随着由Rho GTP酶调节的肌动蛋白纤维的重排，癌细胞可以以类似于白细胞的方式突出伪足和外渗。然后渗透的癌细胞必须选择脑微血管，避免被反应性星形胶质细胞杀死。尽管如此，关于脑转移的确切机制尚不清楚，并且很少被转化为临床研究和应用。
研究方法
采用高通量Luminex方法检测了70例可手术NSCLC患者中36个基因的转录水平，其中37例发生脑转移为术后3年内首次复发。采用Cox比例风险回归模型评价基因与脑转移的相关性。采用创面愈合实验和穿孔实验评价目的基因的功能。采用小鼠左心室注射法评价靶基因在体内的作用。
Luminex测定
选择了36个被假设与脑转移相关的基因。 这些基因代表三种功能类别：脑生长和代谢，上皮-间质转化和细胞因子。 从每个NSCLC 的FFPE样品切下石蜡切片用于Luminex测定。
IHC（免疫组织化学）实验
制作石蜡切片，按照操作步骤，最终复染并固定后由病理学家评估并拍照。蛋白质免疫印迹
收集贴壁细胞，细胞裂解处理。测定细胞裂解物中蛋白质浓度。电泳分离3蛋白质，转膜，封闭，一抗/二抗孵育，显色。RT-qPCR
从细胞中提取总RNA，测量RNA浓度，并使用试剂盒逆转录 RNA，进行定量PCR（qPCR）。 分析GAP43的表达水平，并根据管家基因GAPDH的表达水平进行调整。
GAP43敲低和过表达
对于瞬时敲低，设计了靶向GAP43的特异性siRNA和阴性对照siRNA，并将其插入特定载体中。对于瞬时过表达，将GAP43 cDNA亚克隆到相应载体中。转染后收获细胞以验证GAP43水平的改变。对于稳定的GAP43敲低，应用慢病毒载体。通过蛋白质印迹证实GAP43敲低。
伤口愈合测定
将细胞接种到孔中，并且在去除插入物后，形成无细胞间隙。放大倍数下拍摄间隙的多个延时图像。
Transwell迁移和侵袭测定
体内转移试验
用4-6周龄的BALB / c（nu / nu）雄性裸鼠，每组10只小鼠。 用PBS处理小鼠后。 使用生物发光成像（BLI）每周监测转移性病变。
免疫荧光测定
贴壁细胞固定后，并用Triton X-100透化。将鬼笔环肽缀合物工作溶液加入到载玻片的每个孔中，并在室温下与细胞一起温育，避光。 将细胞核用DAPI在室温下染色，密封载玻片。 使用共聚焦显微镜拍摄荧光。
F-肌动蛋白/ G-肌动蛋白比率测定
使用F-肌动蛋白/ G-肌动蛋白体内测定试剂盒提取和分析蛋白质。通过蛋白质印迹定量沉淀和上清液中的肌动蛋白。 使用ImageJ软件测量每个条带的灰度值。
Rac1活化测定
应用Rac1活化测定试剂盒制备蛋白质。从细胞中提取蛋白质并分成两个相等的部分，通过蛋白质印迹检测总Rac1和活性Rac1。
生长相关蛋白43（Growth-associated protein 43，GAP43）与脑转移有关。多因素Cox回归分析显示，GAP43升高的非小细胞肺癌患者脑转移风险比低水平患者增加3.29倍（95%可信区间：1.55-7.00；P=0.002）。Kaplan–Meier生存曲线显示GAP43也与总生存率相关。一组1926名NSCLC患者的分析显示了类似的结果：GAP43水平高的患者的无进展和总体存活率更差。
此外，体外实验表明，GAP43促进细胞迁移。动物研究表明，与对照细胞相比，GAP43沉默的NSCLC细胞转移至脑和骨的可能性较小。免疫荧光和F-actin/G-actin体内实验表明GAP43基因敲除触发了F-actin细胞骨架的解聚。 Rho GTP酶活化测定显示在GAP43沉默后Rac1失活。
研究结果表明，GAP43是NSCLC脑转移的独立预测因子，它可能通过调节Rac1 / F-肌动蛋白途径促进转移。
前面蛋白质免疫印记和免疫组化实验中用到的GAP43 抗体由华安生物提供。
实验结果图
Fig e. Representative images of immunohistochemistry staining for GAP43 expression in primary NSCLC tissues and corresponding brain metastasis tissues; magnification, ×400. A total of 3/5 brain metastasis tissues showed an elevated level of GAP43 expression compared with paired NSCLC tissues. f. Expression levels of GAP43 in NSCLC cells evaluated by western blotting.
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