分子印迹整体柱-固相萃取-LC-MS法分离检测茶叶粗提物中咖啡因

王超^1,2,3，孙亚坤^1,2,3，刘照胜^1,2,4,*，阿吉·艾克拜尔艾萨^1,2,*

(¹中国科学院新疆物理与化学技术研究所，乌鲁木齐, 830011，²中国科学院新疆特有药用资源利用省部共建国家重点实验室培育基地， 乌鲁木齐, 830011，³中国科学院大学，北京，100039，⁴天津市临床药物关键技术重点实验室，天津医科大学药学院，天津市，300070)

关键词：儿茶素，咖啡因，分子印迹整体柱，固相萃取，LC-MS

分子印迹技术是在目标化合物存在条件下，通过聚合反应制备对目标分子具有特异性识别能力的聚合物的技术。但在一些情况下，目标化合物价格比较昂贵或者不容易得到。伪模板（与目标化合物结构相近的分子）可以很好的解决这一问题。固相萃取是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液将目标化合物洗脱，从而达到分离和富集目标化合物的分离纯化技术。本文以儿茶素为伪模板分子，在大分子拥挤试剂聚苯乙烯存在的条件下，成功合成了分子印迹整体柱；并将印迹聚合物作为固相萃取吸附剂，从茶叶粗提物中对咖啡因进行了分离纯化，然后用LC-MS检测以及确定咖啡因的结构。

1 实验部分

将伪模板分子儿茶素，功能单体4-VP，交联剂EDMA，引发剂AIBN按照一定的配比溶解于一定量的致孔剂聚苯乙烯/四氢呋喃溶液（PS/THF，40mg/mL，M_PS = 350,000 g mol^-1）和甲苯中，组成预聚混合物。然后将预聚混合物超声30 min，使之均匀、澄清。最后将预聚混合物注入不锈钢柱(100 mm×4.6 mm i.d.)中，用生料带将不锈钢柱两端封住，将其放置在55℃恒温水浴郭中反应24小时。反应结束后，将不锈钢柱取出，并将其连接于高压泵上。先用四氢呋喃冲洗整体柱，以除去残留的致孔剂合和未反应的试剂，然后用甲醇/乙酸 (9/1, v/v) 冲洗整体柱，以除去模板分子。四氢呋喃和甲醇/乙酸总体积约为 150 mL。最后用流动相将整体柱平衡。

将冲洗干净的印迹聚合物从不锈钢柱中取出，然后研磨，用45 μm筛对研磨后的聚合物进行筛分。然后用湿法装柱，将筛分后的聚合物装入自制的简易SPE柱中，设置径高比为1:4。将浓度约20 mg/mL的甲醇溶茶叶粗提物进行上样，上样量为500 μL; 然后以水为淋洗剂，淋洗体积为30 mL; 然后，以乙腈/水（1/9, v/v）按1mL为一个单位进行洗脱，只回收4-6 mL。最后，将洗脱4-6 mL样品用LC-MS进行检测和确认。

2 结果与讨论：

首先，我们将洗脱4-6 mL样品通过LC-MS，在14.9 min左右时得到一比较纯的化合物，质谱分析显示得到一质荷比为194的基峰。我们推测，该化合物可能为咖啡因，然后将咖啡因标准品通过高效液相进行检测，其出峰时间恰好也在14.9 min，说明该物质确实是咖啡因。所得结果如图1所示。通过固相萃取所得的咖啡因，在保证其纯度为95%以上时，回收率可达85%。

3结论：

本研究使用儿茶素作为伪模板，在大分子拥挤试剂环境下合成了印迹整体柱，该印迹整体柱可作为固相萃吸附剂，进一步应用于茶叶中咖啡因的纯化分离，并得到较好的结果。

图1. 茶叶粗提物，咖啡因标准品及洗脱样品色谱图。色谱条件: Waters Sunfire C18 column 5 μm (250 mm×4.6 mm i.d.)；流动相：乙腈/0.2% H₃PO₄水溶液(86/14, v/v), 0-30 min；流速, 1.0 mL/min; 检测波长,280 nm；进样体积 20 μL；柱温 30 °C。

参考文献：

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