抑郁症来源的血浆外泌体通过sigma-1受体传递改善炎症诱导的抑郁样行为

背景

重度抑郁症 (MDD) 是一种常见的致残性精神疾病，影响着全世界数百万人。目前推荐的 MDD 一线抗抑郁药是选择性血清素再摄取抑制剂 (SSRIs) 和双重血清素/去甲肾上腺素再摄取抑制剂 (SNRIs)。然而，由于它们在临床实践中起效低且效率有限，仍然无法满足抗MDD的需求。因此，有必要寻找有效的替代治疗方法。

外泌体是一种细胞外囊泡 (EVs) 的亚型，直径约为 40-160 nm，起源于多种类型的细胞，是多泡体 (MVB) 与质膜融合的结果。外泌体富含丰富的细胞成分，如脂质、蛋白质、DNA、mRNA、 miRNA和一些代谢物。值得注意的是，作为一种天然纳米载体，外泌体携带多种分子，启动细胞内通讯并触发受体细胞的生物反应。例如，来自 NK 细胞的外泌体可以通过 miRNA 传递缓解小鼠慢性轻度应激诱导的抑郁症状。骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 衍生的外泌体可缓解皮质酮引起的抑郁症中的海马神经元损伤。最近，越来越多的研究表明，外泌体在 MDD 的病理过程中发生了变化。抑郁症的外泌体可能具有抗抑郁样作用。

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材料和方法

1、受试对象

中国徐州医科大学附属医院招募 6 名未用药 MDD 患者和 6 名健康志愿者。本研究获得徐州医科大学附属医院伦理委员会批准 (XYFY2019-KL207-01)。

2、动物

雄性C57BL/6小鼠 (22-25 g)，Sigma-1 受体基因敲除小鼠。

3、细胞培养

小鼠来源的小胶质细胞系BV2和人胚肾HEK293T细胞，Sigma-1敲除的HEK293T细胞，原代小胶质细胞培养。

4、抑郁模型 

炎症引起的抑郁症模型：小鼠腹腔内注射脂多糖 (LPS) (0.83 mg/kg)。慢性束缚应激 (CRS) 引起的抑郁症：将小鼠束缚在带有一些孔的 50 ml 塑料离心管中 (2 小时，每天一次，持续 14 天)。通过行为学测试确定抑郁样症状。

5、行为测试

强迫游泳 (FST)，悬尾测试 (TST)， 旷场测试（OFT），蔗糖偏好测试。

6、血浆外泌体制备和治疗

将小鼠 (约 1 ml/只) 和人类 (约 3 ml/人) 的血样收集在涂有 EDTA 的试管中，然后以 3000 g 离心 15 分钟。上清液通过 0.22 μm 过滤器，然后以10000 g 离心 20 分钟以获得血浆。将血浆样品与外泌体提取试剂混合。将纯化的外泌体重悬于 100 μl PBS中并储存在 - 80 °C。为了标记外泌体，将 1 μM Dil (Invitrogen) 与外泌体在 37 °C 下混合 15 分钟。然后将混合物在 4 °C 下以 110000 g 离心 1 小时。洗涤两次后，将沉淀（外泌体）重悬于 100 μl PBS 中。外泌体的特征通过标记蛋白 (CD9、CD63 、TSG101)、透射电子显微镜 (TEM)和纳米粒子追踪分析 (NTA) 鉴定。

为研究外泌体的抗抑郁样作用，在 LPS 给药前 30 分钟将外泌体 (40 μg/只) 静脉注射到小鼠尾静脉中。在行为学测试中，在 LPS 前 30 分钟注射氟西汀 (30 mg/kg，ip，Cat# F189157，China) 作为阳性对照。在 LPS 刺激的 BV2 细胞或原代小胶质细胞 (200 ng/ml，24 小时) 中，在 LPS 处理前 30 分钟使用 50 μg/ml 外泌体。

7、统计分析

通过Anderson-Darling检验、D'Agostino和Pearson检验、Shapiro-Wilk 和Kolmogorov-Smirnov进行正态性检验。如果其中一项通过，则使用ANOVA 分析数据，然后进行Tukey的多重比较测试。所有测试均由GraphPad软件 8.0 版操作。统计学显著水平设定为P< 0.05。

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结果

1、血浆外泌体对 LPS 引起的抑郁样行为的影响

分离验证来自对照小鼠 (Con-EXO) 和 LPS抑郁症小鼠 (LPS-EXO) 的血浆外泌体。血浆外泌体呈茶杯状双面结构，具有特异性标志物CD9、CD63、TSG101。将血浆外泌体静脉注射到 LPS抑郁小鼠中，结果表明，外源性 LPS-EXO 治疗逆转了LPS抑郁小鼠的TST和FST 不动时间增多。在本研究中，外源性 LPS-EXO 处理改善了 LPS 诱导的蔗糖偏好下降。此外，LPS-EXO 增加了旷场试验的中心探索时间。此外，作者还在 CRS抑郁症小鼠中注射了 LPS-EXO 或 Con-EXO，以确认它们的生物学功能。与 LPS 诱导的抑郁症小鼠中的这些发现一致。

在 TST 和 FST 中，经 LPS 处理的 CRS-EXO 或 MDD-EXO 小鼠的不动时间减少。它们还改善了蔗糖偏好并增加了 OFT 的中心时间，但运动总距离未发生显著变化。表明来自抑郁症的外泌体改善了 LPS 诱导的抑郁样行为。

2、来自抑郁症的外泌体减轻 LPS 诱导的抑郁症中 BDNF 的缺乏和小胶质细胞的激活

众所周知，脑源性神经营养因子 (BDNF) 是参与 MDD 病理生理学的突触可塑性的关键调节蛋白之一，是传统抗抑郁药或氯胺酮治疗作用所必需的。因此，作者研究了注射不同来源的外泌体对BDNF表达的影响。如图所示，LPS导致海马中 BDNF 表达不足，而外源 LPS-EXO挽救了这种变化。和LPS-EXO一致，MDD-EXO或 CRS-EXO 治疗也促进 BDNF 表达。

越来越多的研究表明，小胶质细胞是大脑炎症反应的关键因素之一。作者检查了LPS 诱导的抑郁症中小胶质细胞活化的变化。通过Iba1免疫荧光发现外周LPS注射可以引起小胶质细胞的激活和促炎介质如IL-1β、TNF-α、iNOS。但来自抑郁症的外泌体可缓解对小胶质细胞活化和炎症介质的表达。此外，来自抑郁症的外泌体还降低了GFAP (星形胶质细胞的标志物) 的表达，表明抑制了炎症激活的星形胶质细胞。这些发现证明抑郁症的外泌体可以在 LPS 诱导的抑郁症中发挥抗抑郁样作用。

3、来自抑郁症的血浆外泌体抑制 BV2 小胶质细胞中 LPS 引发的炎症反应

海马小胶质细胞和 BV2 细胞中发现了 Dil 标记的外泌体，表明血浆外泌体能够进入小胶质细胞。接下来，LPS (200 ng/ml) 触发小胶质细胞 BV2 炎症激活。结果表明，LPS 显著增加 NO的释放以及 iNOS、IL-1β和 TNF-α的 mRNA 表达。LPS-EXO、CRS-EXO 或 MDD-EXO 明显抑制了促炎介质的表达。此外，LPS-EXO、CRS-EXO或MDD-EXO显著抑制原代小胶质细胞中NO的释放，与BV2细胞相似。因此，这些发现证实来自抑郁症的外泌体减轻了小胶质细胞介导的神经炎症。

 4、Sig-1R 存在于抑郁症的血浆外泌体中

与Con-EXO相比，LPS-EXO中可明显观察到Sig-1R的表达。CRS-EXO和MDD-EXO 都发现了类似的趋势。

接下来，作者使用Sig-1R KO HEK293K细胞来进一步评估外泌体 Sig-1R。然而，LPS-EXO共培养增加了 Sig-1R 在Sig-1R KO细胞中的表达，表明抑郁症外泌体中存在Sig-1R。由于Sig-1R的激活可以增加细胞外信号调节激酶(ERK) 1/2 的磷酸化，作者通过测量ERK1/2的磷酸化来研究外泌体Sig-1R是否具有生物学功能。LPS-EXO显著提高磷酸化ERK1/2的表达，表明抑郁症外泌体中存在功能性 Sig-1R。

5、外泌体 Sig-1R 敲除则失去抗抑郁样作用

利用LPS 刺激Sig-1R KO小鼠获得不含 Sig-1R 的外泌体，即 LPS-KO-EXO。在 LPS 引起的抑郁症中，作者观察到 LPS-KO-EXO 没有逆转抑郁样行为。同时，作者发现 LPS-KO-EXO 未能减少 LPS 刺激的小胶质细胞 BV2 细胞中 NO 的释放。因此，外泌体 Sig-1R 有助于抑郁症外泌体的抗抑郁样活性。

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讨论

抑郁症小鼠或患者的血浆外泌体可改善LPS抑郁小鼠中增加的不动时间、快感缺乏样行为、BDNF表达和小胶质细胞活化。外泌体包含许多功能性生物分子。除了众所周知的核酸 (如：mRNA、miRNA) 外，外泌体还可以将蛋白质转移到受体细胞中。在这里，作者提供了外泌体传递Sig-1R的重要证据。

作为一种 223 个氨基酸的蛋白质， Sig-1R主要分布在线粒体相关的ER膜上 (MAM)。在激动剂或应激事件的刺激下，Sig-1R易位到其他细胞空间，如质膜，具有受体特性。此外，Sig-1R结合并调节多种受体、离子通道和激酶。外泌体Sig-1R 的治疗增加了Sig-1R敲除细胞中Sig-1R的表达和其下游ERK1/2通路的激活，表明外泌体Sig-1R有功能活性。此外，外泌体 Sig-1R的敲低消除了外泌体对抑郁症的抗抑郁样作用，也证实了Sig-1R在外泌体中的核心作用。

外周或中枢炎症刺激可能引起小胶质细胞活化释放促炎细胞因子。从而导致抑郁样症状。本研究中，注射外泌体可以抑制 LPS诱导的小胶质细胞活化和BDNF缺乏，表明其存在潜在抗炎作用。此外，作者还发现敲除Sig-1R的外泌体不再表现出抗炎作用。此外，作者的结果显示来自抑郁症的外泌体增加了BDNF在小鼠中的表达，在进一步的研究中，将采用更多类型的模型或工程化外泌体Sig-1R来证实抑郁症外泌体的作用和机制。

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思考

来自各种生理或病理条件的外泌体可能具有不同的生物活性。例如，在作者的研究中，来自 LPS 抑郁小鼠的外泌体40 μg改善了抑郁样小鼠的小胶质细胞活化。然而，有研究报道，LPS 抑郁小鼠注射 1 mg 外泌体会导致小胶质细胞活化。同样，本研究表明，单次给予抑郁症外泌体足以发挥抗抑郁样作用。然而，一项研究表明，利用抑郁症患者的外泌体进行 2 周的慢性处理会导致小鼠出现抑郁样行为。考虑到外泌体的复杂特性，需要对抑郁症外泌体的作用机制进一步研究。

原文：Wang Y, Gao C, Gao T, et al. Plasma exosomes from depression ameliorate inflammation-induced depressive-like behaviors via sigma-1 receptor delivery[J]. Brain, Behavior, and Immunity, 2021, 94: 225-234.

翻译：赵云鹤

审核：李  月

排版：毛悟宇

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