miR143-3p 介导的神经调节蛋白基因（NRG-1） 依赖性线粒体功能障碍导致难治性精神分裂症中的奥氮平耐药

 前言 

据报道，在接受至少两种不同抗精神病药物治疗的精神分裂症(SCZ)患者中，约有 20% ~ 30%会出现持续的精神病性症状。这些患者目前被认为已发展为难治性精神分裂症(TRS)。一些证据表明TRS 可能是SCZ的一个独特亚组，具有更明显的神经发育缺陷。几项研究已经确定奥氮平是一种安全有效的 TRS 抗精神病药物。然而，已发现奥氮平的治疗效果存在个体差异。同时发现基因组个体间异质性是导致抗精神病药物治疗结果存在个体差异的主要因素。到目前为止，大多数关于抗精神病药疗效与风险基因之间联系的研究都是使用外周血单个核细胞或死后组织进行的，这些研究无法解决发育过程中起作用的致病机制。

神经干细胞(NSCs)代表神经发育的早期阶段并具有完整的神经分化能力，来自诱导多能干细胞(iPSC)的 NSC是生成TRS患者特异性发育脑组织的最佳选择，可用于揭示TRS 患者关键发育时期抗精神病药物耐药的机制。本研究旨在通过使用 TRS 患者特异性iPSC以及体内和体外SCZ建模方法揭示TRS患者奥氮平耐药的分子机制，并为开发新的TRS精确治疗策略提供可靠的靶点。

 方法 

1、本研究共招募了 363名接受奥氮平单药治疗的TRS住院患者。基于一系列标准指南，TRS住院患者的阳性和阴性症状量表在奥氮平单药治疗的 8 周试验中，分数降低超过 25% 被认为是奥氮平反应 (OLA-R) 患者，而阳性和阴性综合征量表评分下降低于25% 的 TRS 住院患者被认为是奥氮平无反应 (OLA-non -R) 患者。

2、TRS iPSC 和NSCs ：从外周血单核细胞生成 iPSC，在体外将 iPSCs 直接分化为NSCs 。

3、MK801诱导的体内外精神病模型：制备原代大鼠皮层神经元，使用100μM的MK-801建立了体外SCZ模型，而使用0.25 mg /kg的MK-801生成体内SCZ模型。腹腔注射奥氮平5和10mg /kg。

4、Neuregulin-1 (NRG-1) 基因敲除小鼠的产生：两个靶向缺失Nrg-1基因外显子 2 的单向导 RNA是 5‘-GGAGACAGTGTGATACCGCTGGG-3’和 5‘-AAGTTACCTTATGTACCTTATGG-3’。

5、线粒体形态与功能研究：脑切片制备、线粒体膜电位（MMP）和活性氧水平测定、线粒体钙保留能 (CRC) 及形态肿胀观察、ATP含量及耗氧量测定。

6、动物研究分组：

（1）为了研究奥氮平治疗后NRG-1功能丧失的影响，共有100只小鼠随机分为五组：WT组（n=20）、NRG-1 KO组（n=20）、MK801组（n=20）、奥氮平（10 mg /kg）治疗的MK801组（n=20）和奥氮平（10 mg /kg）治疗的NRG-1 KO组（n=20）。

（2）为了验证奥氮平是否以NRG-1依赖的方式促进miR143-3p的加工，共有24只小鼠被随机分为六组：WT组（n=4）、NRG-1 KO组（n=4）、奥氮平（1 mg /kg）组（n=4）、奥氮平（10 mg /kg）组（n=4）、奥氮平（1 mg /kg）治疗NRG-1 KO组（n=4）和奥氮平（10 mg /kg）治疗NRG-1 KO组（n=4）。

（3）为了研究急性miR143-3p过度表达（OE）是否能挽救NRG-1 KO小鼠对奥氮平的耐药性，共有100只小鼠被随机分为五组：WT组（n=20）、miRNA OE对照组（n=20）、NRG-1 KO组（n=20）、奥氮平（10mg/kg）治疗的NRG-1 KO组（n=20）、奥氮平（10mg/kg）和miR143-3p OE联合治疗的NRG-1 KO组（n=20）

 结果

1、为了研究TRS 相关发育组织中奥氮平耐药的致病机制，我们从患有TRS的 OLA-R 和 OLA-non-R 患者中生成了iPSC。图1A展示了神经元分化范例的示意图；图1B中为生成的iPSC中标记物SOX2和Nanog的免疫细胞化学分析及核型分析图像且对分化2周后生成的NSC进行细胞计数分析等。所有 iPSC 均表达多能性标记、正常核型（图1D、E）。并且与 H9 细胞（人类胚胎干细胞）相似，NSC 标记广泛表达。

图1 从 TRS 患者特异性 iPSC 生成同质的 NSC 群

2、接下来进行了RNA 测序分析，并比较了 OLA-R 和 OLA-non-R NSC 获得的全局基因表达数据。OLA-R和OLA-non-R NSCs的数据分析共获得396个差异上调基因和661个差异下调基因（图2A、B、D）。对 1057 个差异表达（DE）转录本的基因本体论（GO）分析表明，过度表达的生物过程主要与神经系统发育相关（GO: 0007399）（图 2C）。之前的一项全基因组关联研究发现，至少有 60 个候选基因与中国汉族SCZ患者的奥氮平治疗反应相关。取交集后只有NRG-1被发现是 TRS 患者特异性 NSC 中的神经发育 DE 基因（图 2E）。

图2 NRG-1是TRS患者奥氮平耐药的易感基因

3、然后，我们试图研究奥氮平治疗对于在体内NRG-1 功能丧失的影响。我们通过靶向缺失外显子 2 产生了 NRG-1 无效突变体，这将导致移码及敲除NRG-1基因（图3 A、B、C）。NRG-1 的杂合 KO 是可行的，并显示出与 SCZ 相关的神经解剖学和行为异常。

图3 NRG-1 的杂合 KO产生

4、NRG-1 KO 小鼠大脑中深层和上层皮质神经元的密度显著降低（图4A、B）。我们还通过以下方法分析了成熟/未成熟和兴奋性/抑制性突触前神经细胞的密度，在 NRG-1 KO 小鼠中对NeuN、DCX、GLUL 和VGAT进行染色，发现 NRG-1 信号传导促进了皮质神经元中兴奋性神经末梢的成熟（图4C-F）。与在 MK-801 治疗的小鼠中观察到的情况相似，NRG-1 的部分缺失可能导致自发活动增加、前脉冲抑制缺陷的百分比降低以及社交能力和社交新奇偏好受损。值得注意的是，奥氮平对NRG-1 KO 小鼠的治疗无明显效果，但在 MK-801 治疗的小鼠中情况相反（图4G-J），这表明 NRG-1 对 SCZ 的奥氮平耐药机制显著相关。

图4 用奥氮平治疗 NRG-1 KO 小鼠未能缓解 SCZ 症状

5、因为 NRG-1 的缺失与 TRS 患者对奥氮平的治疗反应有关，我们随后在体外和体内研究了 NRG-1 缺失对线粒体功能的影响。通过NRG-1及ErbB 4基因沉默处理的原代皮层神经元引起 NRG-1 表达和 JC-1 的 J-聚集体/单体荧光强度比的快速下降，并增加了 MitoSOX 的荧光响应（图5D-F）。在 NRG-1 KO 线粒体中，钙保留能力（CRC）显著降低（图5G-I，K）。在 NRG-1 KO 小鼠中，线粒体表现出强烈的肿胀、空泡化、破坏和嵴缺失（图5J）。

上述结果表明，神经干细胞中 NRG-1 的缺失显著影响线粒体功能。奥氮平治疗在体外和体内 NRG-1 缺陷模型中都没有缓解线粒体功能障碍（图5D-F，H-K），而靶向 NRG- 1过表达（OE）挽救了奥氮平对OLA-non-R NSCs线粒体缺陷的影响，表明NRG-1是奥氮平对线粒体功能障碍保护作用的核心。MK-801 通过NMDA受体的阻断降低 NRG-1 的表达（图5A，K），而ErbB-4沉默与NRG-1沉默相似，显著增加线粒体活性氧和裂解的Cas9 的表达并降低线粒体膜电位、三磷酸腺苷和耗氧率（图5D-F），但经奥氮平处理后细胞中线粒体功能得到改善（图5D-F）。这些结果表明 NRG-1/ErbB 4信号影响 SCZ 的发展而不是奥氮平反应。

图5 NRG-1 参与奥氮平反应的线粒体功能障碍

6、我们对 NRG-1 KO 小鼠的脑组织和源自 TRS 患者特异性 NSCs的miRNA 测序数据集进行综合分析，以揭示 DE miRNA，并筛选其中在 NRG-1 下游调节线粒体功能障碍的miRNA（图6A-C），最终将 miR143-3p 鉴定为最重要的 NRG-1 依赖性 miRNA。我们还进行了 mRNA 测序以检查miR143-3p OE 时全局基因表达的变化。对 327 个基因的 GO分析显示其主要参与ATP 酶活性负调节（图6D、E）。并且检测了相应线粒体的功能，这些结果突出了 miR143-3p 促进线粒体功能障碍的能力。NRG-1 KD 诱导的线粒体凋亡被 miR143-3p 模拟物减轻（图6F、G），其支持 miR143-3p 作用于 NRG-1 下游以调节线粒体功能障碍的概念。

我们观察到 miR143-3p 作用于 NRG-1 下游，这使我们推测 miR143-3p 可能与 TRS 患者的奥氮平耐药有关。用 1 或 10 μM 奥氮平预处理显著增加了 miR143-3p 的水平，而siRNA 介导的 NRG-1 KD 逆转了奥氮平治疗的效果（图6H）。与使用我们体外数据的分析结果相似，miR143-3p 在奥氮平处理的野生型小鼠中的表达相对较高，但在 NRG-1 KO 小鼠中较低（图6I）。此外，NRG-1 缺陷型 OLA-non-R NSCs 中 miR143-3p 表达没有显著变化，但 OLA-R NSCs 以浓度依赖性方式增加（图6J）。该结果表明奥氮平以 NRG-1 依赖性方式促进 miR143-3p 加工。

图6 miR143-3p 作用于 NRG-1 的下游以调节线粒体功能障碍且奥氮平以 NRG-1 依赖性方式促进 miR143-3p 加工

7、接下来试图研究介导奥氮平诱导的 miR143-3p 加工的 NRG-1 的下游效应物。使用 KEGG 方法，发现几种途径在 miR143-3p OE NSC 中富集，包括氧化磷酸化（KEGG：00190）和 PI3K/Akt 信号通路（KEGG：04151）。因为 NRG-1/PI3K/Akt/mTOR（雷帕霉素靶蛋白）信号被证明与神经和精神疾病有关，我们随后探讨奥氮平诱导的 miR143-3p 上调是否依赖于mTOR。mTOR抑制miR143-3p 加工并逆转奥氮平对 miR143-3p 上调的影响（图7A、B）。因为 p68将初级 miRNA 加工成前体 miRNA，我们假设 mTOR 可以调节 miR143-3p 的成熟。

与对照组相比，mTOR处理的细胞中前体（pre) miR143-3p 的水平显著降低，类似于成熟 miR143-3p 水平的变化，而初级 (pri)miR143-3p 水平没有观察到显著变化（图7F）。与这些发现一致，mTOR 的磷酸化水平(p- mTOR)在 OLA-non-R NSC 中显著降低（图7C）。添加mTOR似乎可以逆转奥氮平对 miR143-3p 上调的影响（图7D）；因此，它损害了奥氮平抑制 OLA-R NSCs 中裂解的 Cas9 表达的拯救作用（图7E）。总的来说，NRG-1 缺陷抑制 mTOR 磷酸化，可以阻止 miR143-3p 成熟，从而导致线粒体功能障碍的增强和奥氮平敏感性的抑制（图7G）。

图7 NRG-1/mTOR/miR143-3p轴的失调导致的奥氮平耐药性结果

 结论

该研究确定了TRS患者对奥氮平产生耐药性的易感基因NRG-1。我们发现 TRS 患者NRG-1的失调与线粒体功能障碍之间存在很强的相关性，这表明NRG-1/mTOR/miR143-3p信号传导的失调导致了TRS患者奥氮平耐药的发生。我们还将 miR143-3p确定为一种潜在有效的预测性生物标志物候选物，以确保未来对TRS患者进行精确的奥氮平药物治疗。

原文：Sun J, Zhang X, Cong Q, et al. miR143-3p–Mediated NRG-1–Dependent Mitochondrial Dysfunction Contributes to Olanzapine Resistance in Refractory Schizophrenia[J]. Biological Psychiatry, 2022. 

https://doi.org/10.1016/j.biopsych.2022.03.012.

翻译：王新霞

审核：李  月

排版：毛悟宇