"SILAC+LC-MS"策略—细胞Exosome蛋白差异组分析利器

       Exosome（外泌体）是具有脂质双层膜结构、直径约为30-150nm、密度在1.13-1.21g/ml的膜性囊泡。Exosome由活细胞分泌而来，几乎所有类型的细胞都能分泌，广泛存在于各种体液中。在exosome的囊泡结构中含有细胞来源相关的蛋白质、核酸、脂质和小分子等物质，能作为信号分子传递给其他细胞以进行细胞间通讯。最近的研究发现exosome在众多生理、病理过程中发挥着着重要作用，如免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。鉴于不同细胞分泌的exosome具有不用的组成成分和功能，故而exosome有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用，此外，基于exosome的膜性结构，亦可作为靶向药物的载体进行疾病治疗。Exosome的这些特性使其成为当前的热门研究对象。Exosome的开放数据库网址：http://exocarta.org/，研究者可查询Exosome的Protein、RNA和lipid等信息。

       用LC-MS为基础的蛋白质组学（proteomics）技术对Exosome中的蛋白质进行鉴定/定量分析，筛选不同来源exosome的差异蛋白，是寻找exosome为基础的biomarker的重要途径。由于exosome中的蛋白质含量极低，想直接从组织、体液样本中直接获得足量的用于LC-MS分析的exosome蛋白是很困难的。细胞系（株）是目前生物学/医学研究的重要素材，因此，用细胞系（株）作为研究材料的优势：（1）通过细胞培养能够获得足够的exosome蛋白质样品，（2）从细胞exosome获得的发现出发，再对组织/体液样本进行验证，不失为一种可行的方案。

         对于差异蛋白质组学技术，很多人最先想到的是iTRAQ(TMT)。然而，对于exosome样品，iTRAQ(TMT) 技术的局限体现在：（1）要获得≥100μg/组exosome蛋白样品，需要培养大量的细胞。如果做重复，需要的蛋白质量更多；（2）实验步骤繁琐，系统误差较大。第二个想到的技术是Label-free，优势：蛋白量要求较少，可以实现。局限：（1）对LC-MS的稳定性要求很高；（2）每个样品至少做3次MS重复；（3）定量偏差较大。

         鉴于上述iTRAQ（TMT）和Label-free技术在exosome差异蛋白质组分析方面的局限性，上海普赛生物科技有限公司基于其完善的SILAC技术平台，开发了SILAC+LC-MS的技术方案，用于细胞exosome差异蛋白质组分析。其优势体现在：（1）SILAC（Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture）技术是通过细胞本身的蛋白质合成过程，直接将质谱标签（MS tag，13C、15N、2H）引入细胞的每个蛋白质上，从源头降低了实验的系统误差，后续MS的定量结果更为精准。（2）所需的蛋白量少，SILAC标记的和未标记的exosome蛋白各20μg左右足够进行MS鉴定与定量。（3）蛋白质提取和后续操作步骤极为简单方便，只需提取exosome蛋白、定量，最后1:1混合即可。（3）蛋白质定量和分析软件成熟（Maxquant和Perseus），结果分析方便直观。

         上海普赛生物科技有限公司利用其开发的“SILAC+LC-MS”的策略，完成了多批细胞样品的exosome差异蛋白质组学分析的项目，以下为代表性项目的数据展示：

一、实验设计：

SILAC+LC-MS方案分析exosome差异蛋白质组流程图。

SILAC+LC-MS方案的主要步骤如下：

1. 对照组细胞（control cells）用普通的培养基培养（K0R0），收获上清并富集exosome。

2. 处理组细胞（treatment cells）用SILAC培养基培养（K6R6，在蛋白质Lys和Arg氨基酸残基上引入6Da的质量差异），收获上清并富集exosome。

3. 分别提取exosome蛋白，定量后1:1混合进行SDS-PAGE电泳分离与染色。

4. 切割条带，trypsin胶内酶解、提肽和LC-MS（Orbitrap Fusion，Thermo Scientific）测试分析。

5. 使用Maxquant软件完成对蛋白质的鉴定与定量，利用Perseus软件对定量数据进行分析，筛选差异蛋白。

二、细胞exosome蛋白质提取鉴定:

不同细胞的exosome蛋白质提取与SDS-PAGE电泳检测。

从5种细胞中提取了exosome蛋白，通过SDS-PAGE的结果可见：（1）蛋白质提取成功；（2）由条带差异可见，不同细胞的exosome蛋白成分有较大差异。

三、SILAC+LC-MS进行exosome差异蛋白分析:

图A. 对照组（controlcells，K0R0）细胞的exosome蛋白与处理组细胞（treatment cells，SILAC-K6R6标记）的exosome蛋白等量混合后进行SDS-PAGE电泳分离。图B. 将图A中的sample泳道等分切割为5个条带，分别进行LC-MS分析，共获得5个MS原始文件。图C. 利用Maxquant软件对5个MS文件进行搜库（database search），利用Perseus对定量数据进行分析，筛选差异蛋白，红色点代表差异蛋白，蓝色点为没有显著变化的蛋白。图D. 代表性的某个差异蛋白的肽段MS强度图。m/z=882.43是对照组（普通培养基，K0R0），m/z=885.44是处理组（SILAC培养基，K6R6），可见处理组中，该蛋白的量比对照组约升高4倍。

• 对照组（controlcells，K0R0）细胞的exosome蛋白与处理组细胞（treatment cells，SILAC-K6R6标记）蛋白，各20μg，等量混合；

• 将胶切割为等分为5个条带，分别用trypsin进行胶内酶解并提取肽段。酶解肽段样品用Orbitrap Fusion（Thermo Scientific）分别测试。

• 使用Maxquant对5个MS文件进行搜库，完成蛋白质的鉴定与定量。共鉴定/定量了837个蛋白（1% FDR，≥2 peptides）。

• 使用Perseus对Maxquant的定量数据进行差异蛋白筛选，共筛选到差异蛋白48个（图C红色点），未有显著差异变化的蛋白789个（图C蓝色点）。

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