斑马鱼中NgAgo实验未能证明韩春雨论文的可重复性
中心法则：DNA-RNA-蛋白质 （图片来源：网络）
昨日（11月11日），自然出版社旗下英文期刊 Cell Research (《细胞研究》) 在线发表了题为《基于 NgAgo 的 fabp11a 基因敲低引起的斑马鱼眼睛发育缺陷》的论文，通讯作者为江苏南通大学神经再生重点实验室副教授刘东。自韩春雨今年5月在《自然-生物技术》发表 NgAgo 基因编辑技术之后，这可能是第一篇通过正规途径发表的有关 NgAgo 的学术论文。论文发表后，多位同领域科学家随即接受《赛先生》采访，对此论文进行点评。
1. 这篇论文是否证明了韩春雨工作的可重复性与重要性？
李大力（华东师范大学生命科学学院研究员）、程临钊（约翰霍普金斯医学院 Edythe Harris Lucas and Clara Lucas Lynn 讲席教授）、王皓毅（中科院动物研究所研究员）、谷峰（温州医科大学教授）、魏文胜（北京大学生命科学学院教授）、黄志伟（哈尔滨工业大学教授）等多位科学家共同表示，该论文并没有重复出韩春雨实验的结果，没有观察到基因编辑现象。
程临钊认为，这篇关于斑马鱼的文章讲的是基因敲低现象，很明显，这并没有为韩春雨报告的基因编辑技术提供任何新证据。他说：“该论文并不是对韩春雨文章的验证。”
魏文胜称，这篇文章表明在斑马鱼中NgAgo不能造成碱基插入与缺失，仍然无法实现基因编辑。
谷峰则非常直接地表示：“这篇文章证明，韩春雨报道的基因组编辑工具 NgAgo 无法对斑马鱼基因组进行编辑。”
文章作者之一王永明（复旦大学生命科学学院研究员）称：“我们的文章是在斑马鱼里做的。结果显示不能切割 DNA，但是可以抑制基因表达，我们推测是结合到了靶基因上并阻止其转录，这并没有支持或者反驳韩春雨教授的结果。”
对此，李大力和王皓毅均表示，论文中描述的抑制基因表达的“敲低”有多种可能的机制，论文作者“推测”其机制与 DNA（抑制转录）有关，但没有给出任何证据表明这一点。因此，该论文与韩春雨提出的基因编辑技术并无直接关联。
2. 韩春雨的 NgAgo 论文发表之后的第一个月，好几个实验室都宣称在细胞中观察到了“基因编辑”，后来在测序之后又纷纷否定之前的结论，是否与这次报道的“基因敲低”（knockdown）有关？
王皓毅评论，这是很有可能的，但是不做系统对照实验（control）的话，很难区分是 gDNA 单独起作用还是 NgAgo 在起作用，所以并没有确定的结论。他认为，在斑马鱼中观察到的可能是瞬时的基因敲低（knockdown）效果。他本人实验室做过的唯一的功能相关实验是 Hprt 基因的敲除，但因 6-TG（6-巯基嘌呤）的筛选实验过程比较长，可能观察不到瞬时敲低的效果，而 CRISPR技术的敲除实验则有很明显的变化。
魏文胜表示，他的实验室利用 NgAgo 在初期也观察到了某些表型变化，但之后意识到这只是基因敲低的结果，而非基因敲除。敲低本身并不令人惊讶，因为 Agonaute 蛋白在真核细胞中就是通过 RNA 来介导基因敲低。
北京大学分子医学研究所教授熊敬维则说，他们尝试过4个斑马鱼基因的突变实验，有一个基因有表型，但没有发现突变，就放弃了。另外，他们还构建了 FokⅠ-NgAgo 融合蛋白来研究 NgAgo／gDNA 是否在 293T 细胞中有介导靶基因突变的功能，他们研究了3个靶基因，没有发现突变，这个实验也不支持 NgAgo 有基因编辑功能。
此外，谷峰表示，在他们实验室 NgAgo 的实验里既没有观察到基因编辑，也没有观察到基因敲低，所以对此不予发表评论。
3. 那么到底什么是基因敲低和基因敲除？与基因（组）编辑有什么区别？
简单说来，我们的生命活动基本由蛋白质作为机器来完成（RNA 的功能也正在越来越多地被发掘），根据中心法则“DNA-RNA-蛋白质”最简化的套路，如果想抑制某个蛋白的功能，可以从 DNA、RNA、蛋白质三个层面进行调控。在 DNA或者基因组水平的调控是最彻底的，基因组编辑（genome editing）即对基因组上的目的基因进行删除、突变、或插入，历史上沿用至今的常用工具包括ZFN（锌指蛋白酶）、TALEN 和 CRISPR。在RNA层面的编辑最常用的是RNA干扰，通过抑制RNA的转录或者促进 RNA 的降解从而降低 RNA 水平，影响其翻译成蛋白质以及相关性状的发生，被称为“敲低”（knockdown）。
中心法则图示。（图片来源：网络）
魏文胜和谷峰则强调：knockdown（敲低）与knockout（敲除）是完全不同的两个概念。基因敲低是将基因表达水平下调，而不涉及靶基因 DNA 本身的变化，基本是不可遗传的。基因敲除属于基因（组）编辑技术，必须是在基因组水平上造成突变，破坏基因读码框，消除整个基因的表达。一般来说，在受精卵水平的基因编辑变化能够稳定地遗传给下一代。敲低与敲除二者最明显的区别是基因组DNA序列是否发生变化。
4. 《细胞研究》论文本身亦存在缺陷
在接受《赛先生》采访的过程中，各位科学家一致表示，这篇研究斑马鱼胚胎发育的文章存在一些不严谨之处，比如主要结论的机制没有直接证据，有必要添加更多的对照实验。
王皓毅说：“我理解的 knockdown 是三种可能：结合在 DNA 上去抑制转录，阻止转录起始或者转录延伸；或者结合在 RNA 上，直接导致 RNA 降解；或者结合在 RNA 上，影响或抑制 RNA 的翻译。按照这篇文章的说法，他们猜测是第一种情况，即结合在 DNA 上抑制其转录，这篇论文数据虽然与这个设想一致，但没有提供直接证据确认这个机制。”
为了更好地揭示机制，几位科学家也提出了自己的建议。王皓毅建议添加一组没有5'磷酸化的 gDNA 对照，因为理论上来说 NgAgo 要和 5'磷酸化的单链 DNA 结合。另外，他建议详细检测 NgAgo-gDNA 注射组的下一代表型，以确认表型是否可遗传到下一代。
中科院上海生科院神经科学研究所杨辉研究员则建议将 fork1 接到 NgAgo 后面，看是否能切割 DNA，这是直接证明 NgAgo 有 DNA 特异性结合的能力；同时做 DNA 标记实验，将 NgAgo 和 GFP 融合，看是否能标记 DNA 特异性位点，如端粒等，这也是 NgAgo 能特异性结合 DNA 的证据。上述实验在ZFN，TALEN，CRISPR 的各种版本，如 Cas9，saCas9，NM 中都得到了很好的验证。
另外，北京大学孙育杰教授早先的研究结果显示，NgAgo 不能与基因组的 DNA结合，因而这篇文章推测“结合”其实是缺乏直接证据的。
魏文胜指出，论文的结果表明其所发现的机制区别于RNAi，因为针对正向和反向两条链设计的单链DNA都能够实现NgAgo介导的敲低效果，的确可能作用于细胞核内的基因组上。一个好的对照实验是拿掉NgAgo的入核信号肽（NLS），看看是否仍然有作用。
5. 该如何看待《细胞研究》发表此论文？
面对该论文，林硕（美国加州大学洛杉矶分校教授）、魏文胜等多位科学家均表示，同仁们应仍旧关注韩春雨发表在《自然-生物技术》杂志的数据。
谷峰介绍说：“之前实名表示不能重复的科学家们已经停止了相关的重复工作，之前的阴性结果应该会于近期在学术期刊正式发布。现在大家都在自己的领域继续做包括新型基因组编辑工具的研发和优化的工作。”
魏文胜提出，要分清楚两个事情：一个是包括 NgAgo 在内的 Agonaute 蛋白家族本身关联的科学问题，里面有趣的分子机制和应用潜质值得研究者继续发掘；另一个是有关韩春雨论文的科学性及重复性问题，二者不能混为一谈。让科学回归科学。
《基于 NgAgo 的 fabp11a 基因敲低引起的斑马鱼眼睛发育缺陷》
Cell Research 文章简介
编译：林小鹿
Fabp11a基因跟糖类和脂类的代谢、炎症有关，但它在斑马鱼胚胎发育中起着什么作用，还是个未知。本文意在研究斑马鱼胚胎的眼睛发育过程中fabp11a基因的功能。作者使用密码子优化的NgAgo体外转录的mRNA和两个靶向fabp11a基因不同区域的正向单链gDNA，注射了一细胞期胚胎。30%的胚胎表现出眼睛发育缺陷。然而，对57个发育缺陷胚胎的基因组DNA进行桑格测序，发现没有任何突变产生。有趣的是，检测fabp11a基因的表达，发现其表达水平下降了。作者又测试了两个反向单链gDNA，发现也能引起和正向gDNA相当的发育缺陷表型。为证明这种表型是fabp11a特异的，作者共注射fabp11a基因的mRNA，发现能恢复突变表型。
那么NgAgo引起的基因表达下调是一种普遍现象吗？作者分别测试了另外4个基因：ta, kdrl, lama1和flt1，用NgAgo和靶向这些基因的gRNA注射胚胎后，惊讶地发现四种情况都能看到基因表达下降。然而通过桑格测序，作者没有看到NgAgo引起ta基因的突变（基因编辑）。
韩春雨实验室报道的NgAgo的基因编辑作用是在37摄氏度的人类细胞中发生的，而斑马鱼的胚胎发育是在28.5摄氏度，那么NgAgo的基因编辑活性是否与温度有关呢？作者测试了在37度培养斑马鱼胚胎，发现NgAgo并不能引起fabp11a和ta发生基因突变（基因编辑）。更有趣的是，作者构建了三个根据结构域预测的NgAgo酶活性失活的突变体，针对fabp11a基因，发现它们仍然能够在斑马鱼胚胎中引起和野生型NgAgo效果相当的眼睛发育突变。经过测序检测，NgAgo失活突变体也不能在fabp11a基因上引起突变（基因编辑）。
进一步，作者发现用传统的morpholino介导的基因敲减技术去敲低fabp11a，能产生和NgAgo类似的表型和略低于NgAgo的效率。而用现在最流行的CRISPR／Cas9基因编辑技术，在fabp11a基因上能得到高效的基因编辑，以及类似NgAgo引起的表型 。
最后，作者用去除了NgAgo可能活性位点的突变体做实验，依旧可以观察到基因敲低现象，作者猜测NgAgo是通过结合到目标基因上阻止基因转录，从而引起基因表达的降低，而不是通过基因编辑发挥基因敲低的作用。但是作者没有进一步的实验证据证明这一点。有意思的是，据《澎湃新闻》报道，北京大学孙育杰实验室发现，用NgAgo去做基因位点标记时，通过光学成像他们发现用NgAgo无法标示出端粒。孙育杰等据此认为NgAgo未必有结合和打开双链DNA的能力。因此NgAgo究竟是怎样发挥基因敲低的功能，还需要进一步研究。
文章的通讯作者是江苏南通大学神经再生重点实验室副教授刘东，从事斑马鱼的血管生成研究。《细胞研究》由中科院上海生化与细胞生物学研究所主办，是目前国内影响因子最高的英文学术期刊。
因系统故障，昨日《赛先生》错发文章版本，发现后立即删除。在此向受到影响的诸位科学家和广大订阅用户致以深深的歉意！今日发布的是文章的最终版本。
② 河北科技大学承诺公布验证时间已到，韩春雨事件未了——韩春雨事件时间表
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