深度长文：为什么CRISPR必须拿诺奖？（下）
德国药物化学博士在读，关注新药研发领域
为了阐明CRISPR是诺奖级成果这一问题，笔者在上半篇文章中已经对CRISPR技术的基本概念和详细发展过程做出了介绍，详见：深度长文：为什么CRISPR必须拿诺奖？（上）。下半篇文章将会着重介绍CRISPR技术在各个领域中的应用，并对相关上市公司进行简单介绍。
IV
植物基因组编辑
2016年初，杜邦公司宣布要开发一种新型糯玉米的消息并没有引起多少人注意。大家不知道的是，杜邦公司培育糯玉米的技术「CRISPR」正悄悄改变着整个育种行业。该公司运用CRISPR技术敲除了玉米中能够编码淀粉合成酶的糯质基因wx1，从而使玉米中直链淀粉的含量减少、支链淀粉的含量增加，以此增加玉米的粘性。
自生命诞生以来的几十亿年内，生命的演化过程一直遵循着达尔文的物种演化理论：通过随机遗传突变获得生存、竞争和繁衍后代等方面的优势。但从农耕文明开始人类就试图改变外部世界，选择性的培育更加优良的动植物。早期的农民通过随机的品种或利用杂交获得新品种，但这与自然进化过程类似，同样依靠的是DNA的随机突变。所以改良过程十分的缓慢，虽然经过了数千年进展却非常的小。
二十世纪初孟德尔的工作为植物育种奠定了科学基础，并且为育种提供了可预测的框架。二战之后随着生物技术的发展又出现了新的育种方式，例如用甲磺酸乙酯、硫酸二甲酯等致突变剂，或者利用电离辐射或者转座子等手段来诱导形成DNA突变，生成新的农作物性状。而现代育种学则更进一步，可以直接利用分子生物学手段对植物的基因组进行改造。比如通过基因重组向植物中引入特定基因形成转基因农作物。
但基因重组技术具有自身的局限性，例如难以准确定位到基因组，或者进行基因的敲除或敲落。那么如何准确定位基因组进行基因编辑呢？1996年约翰霍普金斯大学的Srinivasan Chandrasegaran课题组发现将具备基因组定位功能的锌指蛋白 (Zinc finger protein) 和Fokl核酸内切酶连接在一起，形成了能够对DNA精切定位和切割的工具。但该技术存在很多的问题，其用于基因组定位的锌指蛋白可编程性较差，设计和合成过程非常漫长。而且加州的Sangamo公司牢牢地把控着该项技术的专利，因此极大的限制了该项技术的发展和应用。
十几年之后出现了另一项编程性更强的基因组编辑技术TALEN，让科学家们能够快速、精准的对基因组进行编辑。TALEN在2011年被Nature Method评为当年的Method of the Year，然而TALEN仅仅风光了一两年，就淹没在了CRISPR汹涌浪涛之下。
CRISPR被应用于玉米育种(painting by Gregory Allen)
由于CRISPR技术的出现，科学家能够以前所未有的精确度来操控农作物的基因组。其实CRISPR技术不只能够让育种专家更加便捷的获得预期的作物性状，还能被用于提高多种作物的抗病能力。CRISPR技术诞生短短几年内该技术就被应用于编辑小麦基因组，使其能够抵抗白叶枯病，使玉米，大豆，土豆能够抵抗除草剂。2014年，中国科学院的科学家运用CRISPR以及TALEN技术同时修改小麦Mlo基因的6个基因拷贝，使其能够抵抗白粉病。越来越多的作物正收益与CRISPR技术，使其具有更顽强的生命力。
与此同时，CRISPR对植物生物学研究的推进作用也是巨大的。长久以来科学家一直通过观察自然界存在的天然突变，或者通过人工诱导随机突变来探究作物中基因的功能。而CRISPR却能够以更加快速，更加高效的方式在基因中引入突变，破坏基因的编码区，诱导其产生功能异常的蛋白，以此探究基因的功能。除此之外，CRISPR还可用于靶向miRNA来激活或抑制特定植物基因的表达，或是基因的敲入、替换，甚至运用dCas9来调控植物基因转录等等。
V
动物基因组编辑
除了粮食作物，CRISPR技术也能够对畜牧业产生深远的影响，通过很小的基因组修饰会很大程度地提高养殖动物肉产量。而且与农作物中的应用类似，运用CRISPR技术可以很方便的同时修改动物多个基因，比如中国的科学家利用CRISPR同时修改肌肉生成抑制素基因MSTN和能够控制毛发生长的生长因子基因FGF5，同时提高了山羊的肉产量和毛发质量。
虽然CRISPR编辑的动物能够推动畜牧业的发展，但实验动物研究领域却能最好的体现CRISPR技术的无限潜力。无论是用于病理研究还是新药评价，实验动物都对于现代医学有着极其重要的意义。而实验动物研究最基础，最重要的是获得可靠的动物模型，以此才能模拟人类发病的外在表现形式和内在发病机制。
从上世纪初开始，小鼠就已成为生物医学研究中最常用的哺乳动物模型，现今已有超过三万种小鼠品系，用于从癌症到心血管疾病、失明等一系列疾病的研究。CRISPR技术的出现为小鼠模型的建立提供了高效，快速的技术手段。不仅适用于几乎所有的小鼠品系，还能够极大地缩短所需的时间，同时其成本也相对低廉，其成本仅为传统基因工具的十分之一左右。
虽然小鼠动物模型的应用广泛，但其仍具有一系列局限性。对于诸如囊性纤维化、帕金森、阿尔茨海默病等疾病，它们通常无法表现出疾病的特征性症状，药效评价中也可能出现非典型反应。这就让实验室研究向临床试验研究转化变得异常艰难。CRISPR技术的出现使非人灵长类动物模型的建立变得更加高效。
虽然十几年前就可以通过病毒将外源基因转入猴子基因组内，但CRISPR技术出现以前科学家却无法对猴子基因组进行编辑。在2014年初，南京大学模式动物研究所的黄行许将CRISPR注入单细胞胚胎，通过引入Ppar-γ和 Rag1 组合突变对食蟹猴的基因组进行精确的修饰，以此获得了世界首只基因敲除猴。
CRISPR-Cas9 Horse Baby；by MichaelCammer
除了老鼠与猴，由于CRISPR技术的出现猪也开始成为一种比较重要的动物模型。猪的解剖学结构与人有类似之处，器官大小与人类的相似，而且繁殖周期短、产仔数量多，所以也可以作为动物模型，但更加重要的是猪器官可能成为人类器官移植手术的重要来源。其实长久以来这一直是一些科学家的梦想，但由于技术的限制使它遥不可及。即使是人类之间的器官移植也可能会产生严重的免疫排斥反应，何况是异种之间移植。而且猪内源性反转录病毒(PERVs)的存在也是个很大的安全隐患。
CRISPR技术的出现使我们向猪器官成为人类器官移植来源的追寻之路迈进了一大步。之前的技术主要是通过向猪基因组转移人的某些基因来逃避免疫排斥过激反应，但包括CRISPR在内的基因编辑技术能够直接敲除引起免疫反应的基因，或者直接敲除PERVs基因。
2015年哈佛大学的GeorgeChurch和他的学生杨璐菡共同成立的eGenesis，希望运用CRISPR技术来实现猪人体器官移植的宏伟目标。同年他们便实现了运用CRISPR同时敲除猪基因组内PERVs基因的62个位点这一壮举。之后他们又完成了另一项成就：获得不含PERVs基因的小猪。他们首先在不触发细胞凋亡的前提下大范围敲出猪胚胎结缔组织细胞基因组的PERVs基因，之后采用克隆技术将细胞核转入猪卵细胞，发育形成胚胎之后移植入猪子宫内并成功产下猪仔。
虽然猪器官的应用未来还有很漫长的路要走，但CRISPR的无限潜力使我们更改更早的看到这一天的到来。因杨璐菡对医疗领域的贡献，她入选了世界经济论坛评出的2017年度“全球青年领袖。
除了医疗领域相关的应用，脑洞极大的GeorgeChurch也在进行一项知名度相当高的项目：复活猛犸象。两头在大约两万年至六万年前死亡的两头猛犸象标本为其全基因组测序提供了可能。通过基因组分析可以得到猛犸象与现存的象的基因组变化，并发现了能够编辑与体温感知、皮肤和毛发发育，脂肪组织生成等过程相关的蛋白的1668个基因差异。George组在2015年运用CRISPR技术成功将现代象的其中14个基因替换为猛犸象的基因，但替换所有基因无疑会使一项非常浩大的工程，而且修改完之后的大象细胞并不一定能够克隆并发育成为胚胎。(GeorgeChurch前几年出版了一本书详细解释了他的这一宏伟目标，此书脑洞极大，还包括如何合成人的“手性异构体’’等研究项目)。
复活猛犸象 By NBC
除了以上这些应用，科学家们也在利用CRISPR技术控制遗传过程，修改子代的遗传信息。这项技术被称为Genedrive。在二倍体生物的有性繁殖过程中，后代从父母两方分别获得一组染色体拷贝，这也就意味着亲代的基因 (selfish gene 除外) 有50%的可能性遗传给后代。但运用Genedrive技术可以使遗传信息传递方式改变。
主导这个项目的是GeorgeChurch (又是他) 组的Kevin Esvelt。这项技术的核心是基因的敲入，利用CRISPR技术对特定位点进行精确剪切并插入一段新的序列。而插入的该序列包含生成CRISPR基因编辑系统的的信息，所以它能够自动的将自身拷贝到另一条染色体上，使子代的所有个体的染色体上都包含能够编码CRISPR系统的信息。
如果插入的序列不仅包含CRISPR信息，还包含其他信息，那么该信息也能够在子代快速扩散。比如利用Genedrive在蚊子基因组插入疟原虫抗性基因，理论上在一段时间后该区域内的所有蚊子将会全部携带疟原虫抗性基因。这会成为疟疾疾病预防的重大进展。但很多科学家并没有止步于此，他们设想的是在蚊子基因组插入雌性不育相关基因，使该基因在某些蚊子种群中像病毒一般快速传播，导致该蚊子种群在此区域内快速灭绝。
这会是一项非常可怕的技术，在实验室的实验过程科学家也应该尽全力避免基因修饰过的蚊子扩散到外界。在释放的过程中很难预料影响会扩散到多大的区域内，而且如果使某些区域内的蚊子快速灭绝，尽管有些科学家声称不会产生严重影响，但个人觉得对生态的影响会很难预料，生态系统不会像一些模型预测的那么简单。
除此之外，最重要的问题是如何预防该技术的恶意使用？Genedrive的设计并不十分困难，如果有人向蚊子的基因组中插入某些恶性基因，那么该技术会立即变成Gene Bomb (基因炸弹)。如何安全的使用该技术将会是一个非常大的问题。
VI
疾病治疗
多种动物模型的临床前实验研究已经证明了CRISPR在临床前动物模型中的巨大潜力，也为疾病研究和药物研发提供了重要的工具。但CRISPR技术能不能更加直接的被用来治疗疾病呢？
2013年张锋和GeorgeChurch实验室证明CRISPR编辑人类细胞的可行性之后不到一年的时间，中科院上海生化与细胞生物学研究所的李劲松课题组就使用相同的基因编辑工具验证其治疗遗传病的潜力。他们选择了小鼠白内障遗传疾病模型进行研究，试验中的模型小鼠携带显性突变的Crygc基因能够产生变性的晶状体蛋白而发生混浊导致白内障。结果CRISPR能从小鼠基因组的大约28亿个碱基对中找到并修复突变。
研究人员设计了针对突变Crygc基因的导向RNA并直接将导向RNA和Cas9注入杂合子的受精卵中，之后发现有1/3的新生小鼠白内障症状被治愈。而且治愈的小鼠可以通过生殖细胞将CRISPR-Cas9系统修复的Crygc基因传递到下一代。之后几年科学家又用CRISPR治愈了小鼠的肌萎缩以及肝脏代谢相关疾病，并证明了该技术治疗镰状细胞贫血症，血友病，囊性纤维化，重症联合免疫缺陷等重大疾病的潜力。无论是核苷酸突变、缺失/增加，甚至是染色体异常CRISPR似乎都能胜任。
以上这些研究都为CRISPR技术直接应用于人类遗传病治疗提供了安全性和有效性的初步验证。当然CRISPR的潜力远不止用于治疗遗传病，科学家们还在尝试用基因编辑来阻止人体细胞免遭病毒感染，实际上在此之前第一个基因编辑临床试验正是为了治疗HIV感染。除了传染病领域，癌症也是CRISPR技术应用的领域之一。
基因编辑 By Gloria Pizzilli
虽然基因编辑是一个非常强大的工具，但将动物实验的成果转化为临床研究的胜利并不容易。过去几十年基因治疗所面临的风风雨雨提醒我们医学的进展远比我们想象的艰难。科学家面临的第一个问题是靶细胞的选择，体细胞还是胚胎细胞？
通过修改单细胞胚胎，其发育之后所有细胞的基因组将会被改变，其后代所遗传的基因组也将会被改变，动物模型的实验也证明了该策略的可行性。但该方法面临着这严重的伦理问题。于是体细胞就成了大多数科学家的第一选择。体细胞的基因组修饰无法遗传给后代从而减少了伦理问题，但体细胞的基因组编辑远比生殖细胞论复杂的多，因此我们必须解决选择体细胞做基因组编辑所带来的新问题。
其中最大的问题是药物的递送问题。不同的疾病会影响不同的人体部位，比如亨廷顿氏舞蹈病主要影响脑内神经元，而镰刀状细胞贫血症则影响红细胞，囊性纤维化则主要影响肺部。选择可及性比较高的体内循环系统则是相对容易的方向。而循环系统的治疗方式也有两类：体内基因编辑(in vivo) 和体外基因编辑 (ex vivo)。相对而言，体外的基因编辑方式更加简便，而且有利于质量控制。去年四川大学华西医院的卢铀团队率先开展了世界首个CRISPR人体临床试验，敲除T细胞表面的明星分子PD-1。该团队所采用的正是体外基因编辑的方式。
但并不是所有科学家的思路都与以上的方式相同，首先选择采用体细胞的基因编辑。
2015年3月，5位学者在Nature联名发表文章Don’t edit the human germ line (不要编辑人类生殖细胞，听起来有点像三体监听员回复叶文洁的三句不要回答)，呼吁科研工作者谨慎使用基因编辑工具编辑生殖细胞基因组。但仅一个月后，中山大学的黄军就组的文章上线，报道了使用CRISPR技术编辑86个无活性人类胚胎，以期修改能够导致地中海贫血的HBB基因。虽然实验的结果并不理想，但由于伦理问题该文章在国际上引起了巨大争议。很多人担心如果CRISPR被用于修改人类胚胎基因组来预防遗传病，那么该技术将难以避免的被应用于修改非医学相关的基因问题。尽管如此，黄军就还是被Nature杂志评选为当年的年度十大科学人物。
编辑人胚胎：谁在扮演上帝的角色？(创世纪壁画 by 米开朗基罗)
由于该文章所引发的巨大争议，同年美国、英国和中国在华盛顿联合组织了人类基因组编辑国际峰会，对人类基因组编辑的安全问题、伦理问题和政府监管进行了讨论。在这之后，胚胎基因编辑的伦理争议似乎开始变得没那么激烈，2016年瑞典和英国成为了中国之外的，允许胚胎进行基因编辑的另外两个国家。
由于技术越来越成熟，该领域的研究和文章也越来越多。截止目前共有8篇人类胚胎编辑的文章发表，而其中5篇是在过去两个月内发表的。两周前(9月22日) 黄军就的另一篇文章上线，同样是修饰HBB基因用于治疗地中海贫血，但这一次使用的是克隆胚胎细胞，而且利用的是不具有剪切功能的CRISPR系统 (且携带胞苷脱氨酶)进行碱基编辑，以修饰点突变。
毫无疑问运用CRISPR进行人胚胎基因组编辑能够对人类疾病的预防产生巨大的影响，虽然现在的研究重点主要集中于体细胞基因组编辑，用以治疗疾病，但随着技术的不断进步，CRISPR编辑生殖细胞的潜力会被进一步挖掘，伦理问题也可能因此得到比较好的解决。
VII
CRISPR相关生物技术公司
嗜热链球菌能够将乳糖转化为乳酸，所以常用于奶制品行业。丹麦的Danisco公司首先证明了嗜热链球菌含有的CRISPR序列的功能是细菌的适应性免疫，用以抵御噬菌体入侵（见：深度长文：为什么CRISPR必须拿诺奖？（上））。2011年杜邦公司收购了Danisco，并开始研究如何利用CRISPR抵抗噬菌体感染的嗜热链球菌，更好的制造酸奶和奶酪。同年，Jennifer Doudna还在研究第一类CRISPR系统的时候，她就参与创立了Caribou Biosciences，希望运用CRISPR技术来简化病毒检测的过程。
Emmanuelle Charpentier在2012年也逐渐有了创立公司的想法。在Science文章上线的五个月后，她便与当时还在赛诺菲任高管的老友Rodger Novak以及另一位风险投资家的老友Shaun Foy讨论CRISPR的商业潜力。一个月后Novak决定辞职共同创立一家新公司。之后三人开始积极寻找合作伙伴。
在与Jennifer交流之后他们计划联合George Church和张锋共同创立这家公司，以期简化之后可能存在的专利问题。但不幸的是，由于各种已知和未知的原因之后的商谈极其不顺利。在张锋和Church文章发表的一年半以后，CRISPR技术已经越来越成熟，资本强烈期望介入，成立公司的需求也越来越迫切。
CRISPR专利听证会；来源： Science
但在知识产权、学术信誉、地理因素、媒体报道、诺贝尔奖、商业回报等一系列因素的考量下，对CRISPR技术做出巨大贡献的四个人不仅没有团结一致，反而开始分崩离析、各自为政。Jennifer和Emma二人组的关系也不像从前那么单纯，变得越来越微妙。不仅个人的利益掺杂其中，加州大学、布罗德研究所、哈佛大学、麻省理工、维也纳大学这几个学术机构的利益之争也让局面越来越复杂。
在此之后，Emmanuelle Charpentier, Rodger Novak, Shaun Foy, 以及Chad Cowan共同成立了CRISPR Therapeutics。张锋，George Church, Jennifer Doudna共同成立了Editas Medicine。Erik Sontheimer, Luciano Marraffini, Derrick Rossi和 Rodolphe Barrangou共同成立了Intellia Therapeutics。而之后入局的其他公司则需要向以上这几家公司和布罗德研究所支付高昂的专利授权费。
在2014年关键专利授权给张锋之后一个月，Jennifer离开了Editas，加入Intellia。
VIII
写在最后
我想现在已经很难找到一个没有听说过CRISPR这个名词的生物专业学生。短短几年内CRISPR技术已经为基础科研领域，和包括医疗健康以及农业等与大众生活更相关的领域的发展产生了巨大的推动作用。在科学的发展过程中，偶尔会有重大的进展出现，比如相对论，比如DNA双螺旋，比如PCR技术，CRISPR虽然可能不能与以上的突破比肩，但其对科学发展的影响是毋庸置疑的。
Jennifer和Emma的工作为CRISPR作为基因编辑工具的诞生提供了基础，而张锋和Church两人同时证明了CRISPR编辑哺乳动物细胞的巨大潜力。毫无疑问，这些人对于CRISPR技术的诞生与发展做出了重要贡献。但如果没有Jennifer，如果没有Emma，或者没有Church，没有张锋，CRISPR技术就不会出现了吗？显然不是(参见附录的时间线)。
CRISPR能拿诺奖的实力争议很小，但谁最后能够拿到诺奖却是个很大的谜团。科学界并不像人们想象的那样单纯，在利益和荣誉面前多数会变的不理性。在关于CRISPR的战争中，有人获得了金钱，有人获得了荣耀，有人开心，但也有人失落。
如果说CRISPR技术推动了科学的进展，使我们更加憧憬未来的美好生活，那么关于CRISPR技术的利益之战和荣誉之争，却更让我们理解了人的本性。
CRISPR Me by Michele Tragakiss
附录：CRISPR时间线
CRISPR的发现与其功能
1987年，日本大阪大学石野良纯第一次发现了CRISPR序列。
1993年，西班牙阿利坎特大学Francisco Mojica第一个确定现今被称为CRISPR的位点。
2000年，Francisco Mojica发现并报告了之前发现的该差别重复序列存在某些共同的特征（他在与RuudJansen的通信中使用过CRISPR这一名词，后者在2002年在文章中正式使用这一名词）。
2005年，Francisco Mojica发现该序列与噬菌体基因组中的某些片段向匹配，并由此推测CRISPR属于适应性免疫系统。另一课题组也在同期独立报道了类似的研究(Pourcelet al., 2005)。
Cas9与PAM的发现
2005年5月，法国国家农业研究院（INRA）Alexander Bolotin, 在研究嗜热链球菌的过程中发现了一个与众不同的CRISPR位点(Bolotin et al., 2005)，该CRISPR系统缺乏之前熟知的cas蛋白基因，而还有其他未报到过的新cas蛋白基因，其中之一正是编码后来被命名为Cas9蛋白的cas基因。而且他发现，与病毒DNA匹配的间隔序列一端均含有一个相同序列PAM(protospacer adjacent motif)，PAM是CRISPR目标序列识别所必须的。
适应性免疫假说
2006年3月，美国国家生物技术信息中心Eugene Koonin通过计算分析直系同源蛋白，并提出了CRISPR级联为基于插入噬菌体同源DNA到间隔序列的细菌免疫系统的假设，摒弃了之前关于Cas蛋白作为DNA修复系统的假设(Makarovaet al., 2006)。
适应性免疫功能的实验验证
2007年3月，Danisco公司Philippe Horvath试图研究广泛应用于奶制品工业的嗜热链球菌对于噬菌体的反应。Horvath及其同事通过实验发现CRISPR系统确实属于适应性免疫：将新的噬菌体DNA片段整合入CRISPR，并用以抵抗该类噬菌体的下一次攻击(Barrangou et al., 2007)。他们还发现Cas9可能是使入侵噬菌体失活过程中唯一必须的蛋白。
间隔序列被转录为向导RNA
2008年8月，荷兰瓦赫宁根大学John van der Oost开始逐渐解析出CRISPR-Cas系统干扰噬菌体入侵的过程。Johnvan der Oost 及其同事发现来源于噬菌体的间隔序列能够转录生产小RNA，成为CRISPR RNAs (crRNAs)，能够引导Cas蛋白靶向目标基因(Brouns et al., 2008)。
CRISPR如何作用于DNA靶标
2008年12月，美国西北大学Luciano Marraffini 和 Erik Sontheimer发现系统作用的靶标是DNA而非RNA (Marraffini and Sontheimer, 2008)。由于人们一直以来都认为CRISPR和RNAi具有类似的机制，这一发现让研究人员感到意外。Marraffini和 Sontheimer 表示该系统如果能够转移到非细菌系统中，将可能开发成为强大的工具 (需要注意的是有的CRISPR系统可以靶向RNA (Hale etal., 2009)。
Cas9 剪切目标DNA
2010年12月，加拿大拉瓦尔大学Sylvain Moineau及其同事发现可以靶向DNA并在精确位点（PAM上游三个核苷酸）引起双链断裂(Garneau et al., 2010)。他们同时确证Cas9是CRISPR-Cas9体系剪切过程所需的唯一蛋白、由单个蛋白（此处为Cas9蛋白）和crRNAs介导的干扰过程是第二类CRISPR系统的独有特征。
Cas9 系统中tracrRNA的发现
2011年3月， Emmanuelle Charpentier课题组完成CRISPR-Cas9系统介导干扰过程的机制解析的最后一块拼图。他们通过包含CRISPR-Cas9系统的产脓链球菌测序发现除了crRNA，尚存在第二个RNA，称为tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA) (Deltcheva et al., 2011)。该RNA与crRNA形成双链，并介导Cas9靶向DNA靶标。
CRISPR 系统可以在异种生物中起作用
2011年7月，立陶宛维尔纽斯大学,Virginijus Siksnys及其同事克隆了嗜热球杆菌（含有第二类CRISPR系统）的整个CRISPR-Cas位点，并在大肠杆菌（不含有第二类CRISPR系统）中表达，并发现其能够气功质粒抗性(Sapranauskaset al., 2011)。以上实验表明具有独立的功能，而且第二类系统所需的组分都已发现。
Cas9介导的剪切过程解析
2012年9月，立陶宛维尔纽斯大学 Virginijus Siksnys及其同事利用以上在大肠杆菌中表达的系统确证了Cas9的作用机制(Gasiunas et al., 2012)。他们确定了PAM的作用以及剪切位点，通过点突变发现RuvC结构域能够剪切非互补链，而HNH结构域能够剪切互补连。同时表明crRNA序列最少只需要20个核苷酸，更重要的是他们发现通过更改crRNA序列可以引导Cas9靶向对应的DNA位点。
2012年6月，美国加州大学伯克利分校Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna与Virginijus几乎同时报道了相同的发现(Jinek et al., 2012，该文章提交时间晚于Gasiunas等人文章)。但他们发现crRNA与tracrRNA能够融合形成一条RNA，简化了该系统。同时他们报道了运用该系统对GFPDNA进行剪切。
应用CRISPR-Cas9 进行基因组编辑的验证
2013年1月，哈佛-麻省理工布罗德研究所张锋和哈佛大学George Church在同期的科学杂志报道了运用CRISPR-Cas9系统成功进行真核细胞内的基因组编辑。他们的研究表明CRISPR-Cas9系统能够剪切人类以及老鼠细胞内基因组的多个位点，并能引导同源重组修复。