白泽专栏丨CAR-T转基因技术盘点（前篇）
截止撰稿前（2018年2月6日），在ClinicalTrial.gov上搜索“CAR T”可以检索到391项CAR-T相关的临床研究。其中，中国大陆区是159项，韩国1项，台湾2项，日本4项。值得关注的是美国总共153项临床研究（主要分布在加州，宾夕法尼亚州和德克萨斯州），在总数量上中国已经超过美国成为CAR-T相关临床试验的第一大国。然而，在CAR-T的生产过程中，一个重要的环节就是修饰基因的导入系统，如何1）低毒性、高水平、稳定的基因转移到宿主细胞；2）安全，即低水平的基因毒性和免疫原性；3）经济可行性，即可接受的费用（按病人的标准计算）的基因导入系统是值得关注的课题。
图1.（https://clinicaltrials.gov/ct2/results/map?intr=CAR+T&map=）
图2.基因治疗的基因导入系统[1]
如图2所示，目前的基因导入载体系统可以大体分为病毒和非病毒载体，病毒载体可以通过转染导入DNA或RNA。病毒载体可以根据是否整合入靶细胞核染色体进一步分为整合和非整合载体。非整合病毒根据来源分为腺相关病毒（AAV）腺病毒，孢疹病毒1（HSV-1）和杆状病毒（Baculo）,整合病毒载体主要为慢病毒(HIV-1)和反转录病毒（Retro）。非病毒非整合基因载体系统，如核酸酶，质粒和质粒样载体可以通过脂质体和纳米颗粒转染或核转染。然而，自然的基因导入载体如睡美人（SB）和PB转座子可以克服瞬时表达的问题，转座子具有固有的稳定表达整合入核基因的能力，因此，提供了一个长时间或者永久性的基因治疗可能。SB转座子系统在应用到细胞的导入时可以包含了非病毒和病毒技术。
本文主要结合现在CAR-T细胞的导入方法和临床应用，包括SB，PB，lentivirus和Retro进行比较论述，并对其原理做简单介绍：
1. Sleeping Beauty Transposon System(睡美人转座系统)
睡美人转座子系统是一种合成的DNA转座子，旨在将精确定义的DNA序列导入入脊椎动物的染色体中，以引入新的特征并发现新的基因及其功能（Wikipedia）。
图3.迪士尼经典动画片《睡美人》中的奥罗拉（Aurora）
和1997年明尼苏达州大学的Ivies1997年设计的质粒（Hackett LabPlasmid Information）
睡美人转座子是Tc1/mariner转座子超家族中的一员。之所以叫做“睡美人”是因为Tc1/mariner转座子原本是人类、动物和鱼类等脊椎动物天然的遗传分子，但是经过亿万年的进化历程和突变积累，大多数转座子失去活性。1997年明尼苏达州大学的Ivies等收集了来自8种不同鱼类品种中的12个失活的鲑鱼科亚家族Tc1类转座酶基因的序列，经过多重序列比对（Multiple Sequence Alignment)，并进行了分子重建，使其恢复能力。这项研究使沉睡了一千多万年的转座子再次被激活，因此被命名为“睡美人”。
一、机制及结构：
图4.SB调节的转座机制，
顶部的转座子（Transposon）由红色双箭头（IR / DRs）的镜像组定义的转座子显示为包含在另一个DNA分子（例如蓝线所示的质粒）中。本实施例中的转座子含有由启动子（蓝色椭圆形）组成的表达盒，所述启动子可以指导基因或标记为“遗传货物”的其他DNA序列的转录。中线：睡美人（SB）转座酶如图所示与IR / DR结合并将转座子从质粒中切出（切割位点由剩余质粒中的两条黑色斜线表示）底部两条线：另一个DNA分子绿色）与TA序列可以成为转座转座子的接受者。在此过程中，插入位置的TA序列被复制。
睡美人转座子系统包括SB转座酶(Transposas)与特定的DNA sequence转座子（Transposon）可载入两个特定的质粒（Plasmid）导入细胞再插入特定的位置（TA Site）. 转座是一个精确的过程，其中从一个DNA分子中切出确定的DNA片段并移动到相同或不同DNA分子或基因组中的另一个位点。在包括人类在内的哺乳动物基因组中，大约有2亿个TA位点。TA插入位点在转座子整合过程中是重复的。TA序列的这种重复是转座的标志，并且用于在一些实验中确定机制。转座酶可以在转座子内编码（例如，图5中所示的转座子），或转座酶可以由另一个来源提供，在这种情况下转座子变成非自主元件。非自主转座子（例如图4）作为遗传工具最有用，因为插入后它们不能独立地继续切除和重新插入(wikipedia)。
图5：SB转座酶的结构特征。
360个氨基酸的多肽具有三个主要亚结构域：1)负责与转座子的镜像IR / DR序列中的DR序列结合的氨基末端DNA识别结构域，核定位序列（NLS）和DDE该区域催化包含转座的切割 - 粘贴反应组。2)DNA识别结构域具有两个可与DNA结合的配对盒序列，并且与一些转录因子上发现的各种基序有关; 两人配对盒子被标记为PAI和RED。催化结构域具有在许多转座酶和重组酶中发现的标志性DDE（有时是DDD）氨基酸。3)此外，还有一个高度富含甘氨酸（G）氨基酸的区域。
二、构建
图6. SB转座酶的构建。
步骤1：在现代鲑科动物基因组中已经灭绝的Tc1 /mariner状转座子的示意图; 步骤2 x，错义突变S终止突变; F，移码突变; G，主要缺口/缺失氨基酸。步骤3：消除间隙（G）和终止和移码突变。步骤4：重建二分NLS序列（橙色下划线）。步骤5-8：重构N-末端DNA结合结构域（橙色下划线）。步骤9-10：重构包含签名DDE残基（绿色框）的催化结构域（橙色下划线）。
在鲑鱼的基因组中发现。与人类一样，约20,000个灭活的Tc1 / mariner型转座子几乎占人类基因组的 3％，由于累积的突变，在鱼中发现的转座酶基因已失活超过1000万年。SB转座酶的重建基于这样的概念。
转座酶的构建起始于将来自大西洋鲑鱼（Salmo salar）的两个无活性转座子序列和来自虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的一个无活性转座子序列的一部分融合，然后修复转座酶功能域中的小变异（图6 ）。第一个完成的转座酶中的每个氨基酸称为SB10，由“majority-rule consensus sequence”确定序列，基于在8种鱼类中发现的12个部分基因。第一步（图6中的1-> 3）通过填充序列中的空位并逆转终止密码子来恢复完整的蛋白质，这将保持假定的360-氨基酸多肽不被合成。下一步（图6中的4）是逆转核定位信号（NLS）中的突变，其需要将转座酶从其制成的细胞质导入其作用的细胞核中。包含用于识别直接重复序列（DRs）的DNA结合基序的转座酶的氨基末端在步骤5→8中恢复。最后两个步骤恢复了催化结构域，其特征为保守的天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）具有特定间距的氨基酸，在整合酶和重组酶中发现这些氨基酸。最终的结果是SB10，其中包含所有功能所需的motifs（元件）。
三、应用
图7. 睡美人转座子应用
SB转座子已经发展为非病毒载体，用于将基因引入脊椎动物的基因组中并用于基因治疗和基因的发现。1）转基因：制作转基因动物；确定基因的功能；确定癌基因。2）插入突变基因：基因治疗；确定基因功能；确定癌基因。
1. 睡美人转座子系统在临床前模型中的in vivo应用
转座子载体的高效胞内导入确实是个挑战，与病毒不同，裸核酸（DNA和mRNA）缺乏通过感染穿过细胞膜的能力。因此，有必要将转座子载体与能够将这些非病毒载体有效递送到细胞中的技术结合（图2）。目前，最有前途的策略之一是基于杂交腺病毒/转座子载体和高活性SB100X转座酶的体内基因转导系统（图8）。在最近的一项研究中，自体造血干细胞被外周血中激活，并且使用混合的腺病毒/转座子载体系统在体内直接靶向造血干细胞，并且在人源化动物模型中产生功能性造血干细胞。其中，静脉注射一种杂合腺病毒（HD-Ad5 / 35 ++）/ SB载体系统整合到转基因小鼠的血中并表达人CD46，而CD46是在HSC上特异表达的受体，并且体内稳定的表达HSC的CD46。该方法的潜在优势在于它不需要体外扩增和转染HSC。 潜在的缺点是基因操作的效率不如使用lentiviralvectors和ex vivo的临床试验报道的那么高; 因此，这一方法需要进一步的改进。尽管如此，该系统有可能克服现有的与细胞收集和离体产业化相关的技术和/或医疗困难，并提供真正的技术进步。
图8.使用混合腺病毒/转座子载体系统体内转导小鼠造血干细胞（HSCs）的图解。
2.睡美人转座系统在临床前模型中的Ex vivo应用
在体外基因导入中，将治疗性基因载体导入供体分离的选定细胞群中，并将基因工程细胞移植入患者（图9，）。与In vivo应用类似，转座效率取决于细胞摄入引入的核酸的效率。原则上，开发用于将核酸转移入细胞的技术都可以与转座子载体组合。在包括人原代细胞难转染细胞中，核转染可以显著促进基于转座子的载体的导入。基于SB转座的非病毒基因导入系统具有为一系列遗传疾病提供创新和潜在治愈性治疗的突出潜力。在基因治疗中使用SB的主要例子包括血液疾病，溶酶体贮积病，肺部疾病，皮肤病，各种代谢疾病，神经系统疾病，肌肉疾病和癌症的治疗。如下所述，这种强大的非病毒基于转座子的方法目前正在人体临床试验中。
图9.睡美人（SB）转座子在T细胞中的Ex vivo应用表达用于抗白血病和淋巴瘤的嵌合抗原受体（CAR）
3.睡美人转座系统遗传修饰CD19+CAR-T细胞对血液瘤的治疗
非病毒SB基因导入系统的临床应用已经在具有晚期B淋巴细胞，CD19 +急性白血病和淋巴瘤的患者中得到最广泛的应用。 SB系统用于基因修饰T细胞和第二代靶向CD19的CAR，从而将T细胞重定向到表达CD19的肿瘤。大多数先前和正在进行的临床试验已经使用病毒转导来修饰T细胞以表达第二代CAR，其包含与CD28或4-1BB（CD137）共刺激结构域融合的单克隆抗体的单链可变片段（scFv）嵌合CD3-z以提供'信号1和2'（即由CD3-z和CD28启动的信号）（图9）。来自患者的第二代CD19 + CAR-T细胞在患有化疗难治性B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）的患者中显示出活性，其响应率高达90％，总体应答率高达70％。值得注意的是，细胞因子释放综合征（CRS）和/或神经毒性形式的毒性在患者中也有所体现，尤其是那些对治疗有显着疗效的患者。
美国MD AndersonCancer（MDACC）的一个研究小组使用SB非病毒系统将CAR引入患者和供体来源的T细胞。下表1详述了利用SB转座子/转座酶系统在MDACC进行的临床的CAR-T试验。
表1 美国MD Anderson 用SB 转座细胞生产CD19 CAR-T 的临床实验
可以说睡美人转座子最令人兴奋的潜在应用是将用于人类基因治疗。如果载体系统的成本可以承受，那么可以设想在第一世界国家和发展中经济体国家广泛应用基因疗法。由于SB系统仅由DNA组成，与病毒载体相比，生产和成本大大降低。
2.piggyBacTransposon system(PB转座系统)
piggyBac转座子最初在1983年在飞蛾中发现，但直到2005年才被成功用于哺乳动物细胞的基因操作，像其他转座子一样，piggyBac有两个组件，一个转座子和一个转座酶。 piggyBac转座酶促进转座子特异性地整合到随机分散在基因组中的'TTAA'位点。基因组中'TTAA'的频率在每256个碱基对的DNA序列中可预测为1，这对基因工程的方法是非常有用的。然而，对于这种技术最重要的是，转座酶还能够以完全无缝的方式切除转座子，不留下任何序列或突变。此外，piggyBac具有很高的载货能力（超过200 kb已被证明），没有已知的上限。 piggyBac技术可用于多种应用，包括转基因，基因陷阱筛选和基因编辑。
图10，PB转座系统可以广泛的用于插入诱变（RosaLSL-PB敲入小鼠在rosa26启动子的控制下有条件地表达PiggyBac（PB）转座酶）
一、机制及结构[2]：
图11，PB转座系统的机制
如图11，从质粒DNA向基因组中表达了转座酶，不过也可以从一个基因组位点到另一个基因组位点。一旦转座酶被表达（图11，红色圆圈），它就会与piggyBac IRs（inverted repeat）结合并诱导TTAA的切割和亲水攻击。形成发夹并转座子切除。然后将转座子整合并在TTAA核苷酸序列处连接到基因组DNA中，导致基因组转座位处的TTAA靶位点重复。如果需要精确切除，转座酶可以被重新表达并且可以切除转座子，由此在原始位置重建原始的TTAA靶位点。
二、应用
PB转座系统的应用主要包括：1）通过插入诱变发现基因2）转基因动物3）稳转细胞系4)临床相关细胞的修饰5）体内基因转染。其中临床相关应用细胞包括：hiPSCs，并修饰hiPSCs，hESCs，人造血干细胞（HSCs）和人T淋巴细胞。在这里主要对PB转座系统在T细胞中的应用进行简述：
人类T淋巴细胞是用于癌症过继免疫治疗的细胞类型。在临床试验中逆转录病毒被广泛用于遗传修饰T细胞。人类T细胞的转座子介导的基因修饰最先报道使用睡美人系统。最近，一项人类临床试验用于T细胞的睡美人转座子修饰以靶向CD19阳性淋巴瘤。 piggyBac转座子系统也已成功用于人类T细胞的基因修饰。使用piggyBac，随后培养的原代T细胞对数扩增，其中，未经选择的稳定的转基因表达达到约40％。 piggyBac可以同时表达来自两个独立转座子的多个转基因以及转基因表面标记（CD19）用于磁珠选择，大约85％的T细胞培养超过9周。piggyBac也用于在T细胞中表达一个较大的14-kb转座子，并提供一个非免疫原性的自杀基因，编码可诱导的半胱天冬酶9（iCasp9）。在人类T细胞中，整合位点定位显示piggyBac不优先整合到或接近已知的原癌基因。所以piggyBac应该比广泛使用的逆转录病毒更安全，因为piggyBac对原癌基因的偏好较少，并且在T细胞修饰中使用人类逆转录病毒时没有观察到基因毒性事件。使用piggyBac转座子修饰以表达靶向CD19抗原的嵌合抗原受体的人T细胞能有效地杀死表达CD19的人淋巴瘤细胞系，证明了piggyBac修饰的T细胞的功能活性。
表2. piggyBac转座子系统与睡美人转座子系统和常用病毒载体的比较
已显示病毒特异性T细胞在体外进行遗传修饰，然后回输后长期存留在人体内。近期piggyBac被用于在体外和体内基因修饰Epstein Barr病毒特异性T淋巴细胞以靶向表达人类表皮生长因子HER-2的癌细胞。此外，piggyBac最近已被用于通过导入哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）转基因来设计T细胞，这种策略可与雷帕霉素疗法联合用于淋巴瘤。因此，piggyBac已经在人类T细胞中实现了高的基因转染效率，并且能够将细胞扩增至临床数量。piggyBac的独特功能使我们能够转移DNA的大片段，并共表达多个转基因。导入可被选择性激活的自杀基因以消融所有引入的体外修饰的细胞以提高安全性。在临床前模型中，piggyBac基因修饰的人类T细胞能够在体外和体内进行靶向杀死癌细胞。因此，在未来的临床试验中，piggyBac似乎是用于修饰T细胞以用于癌症免疫疗法的有前途的非病毒基因导入系统。
参考文献：
1. Kebriaei, P., et al., Gene Therapy with the Sleeping BeautyTransposon System. Trends Genet, 2017. 33(11):p. 852-870.
2. Woodard,L.E. and M.H. Wilson, piggyBac-ing modelsand new therapeutic strategies. Trends Biotechnol, 2015. 33(9): p. 525-33.
3. Zhang,C., et al., Engineering CAR-T cells.Biomark Res, 2017. 5: p. 22.
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5. Yip,A. and R.M. Webster, The market forchimeric antigen receptor T cell therapies. Nat Rev Drug Discov, 2018.