使用切向流过滤法纯化血红蛋白
在现代医学中，输血是出血性休克、贫血等病症重要的治疗方法，也是常规手术的重要组成部分，但是肝炎及AIDS等小概率传播风险，总是干扰着输血的安全进行。此外，输血前，还需对供体血液进行分型，并与受体血型交叉匹配，以避免出现排异现象。对此，一种相对简便的替代方法是，使用血红蛋白（Hb）类氧载体（HBOCs）取代供体红细胞（RBCs），其具有以下优点：首先，由于HBOCs表面没有血型抗原，一般不会引起排异现象；其次，在Hb纯化过程中灭活并清除了病毒，所以大大降低了血源性疾病传播的可能性。
Hb通常从人或牛RBCs（hRBCs或bRBCs）中提取。对纯化的Hb进行化学修饰是HBOCs合成的一种主要途径，化学修饰型HBOCs可以通过分子内交联Hb、聚合Hb或将聚合物结合到Hb表面的方法来完成。Hb也可以包埋到固体或中空颗粒内部，以形成非化学修饰型HBOCs。
从裂解的RBCs中提取并纯化Hb前，需先去除血液中的白细胞、血小板及血浆成分，可先离心并漂洗血液，以分离血浆和白细胞层。所得的RBCs再用低渗溶液孵育裂解。
从RBC裂解液中纯化Hb的方法有很多种，包括有机溶液萃取以及离子交换层析分离。层析方法又可以大体归类为吸附方法（Hb被截留在固相介质内，然后溶剂洗脱）或直流方法（杂质被截留，而Hb被洗脱）。直流方法消除了吸附和洗脱过程，但与吸附方法相比，所得的Hb纯度较低。但两者都受到血细胞裂解方法及裂解状态的影响。
在还原剂存在的绝氧条件下进行加热，也可以进行Hb的纯化。在该过程中热敏感性蛋白选择性沉淀，而病毒被灭活，但Hb也有可能因为高温而失活，所以需要添加稳定剂，以防止Hb变性。
过滤也是Hb纯化的常用技术，可有效降低Hb溶液中的病毒载量。但是常规的过滤技术通常需要配合化学修饰和分馏操作，以从未修饰型Hb和其它杂质中分离修饰型Hb，且由于细胞碎片堵塞膜孔，造成流速降低。针对这些问题，本文将介绍一种多阶段式过滤方法。在该方法中，大多数细胞碎片在第一阶段（膜MWCO 50nm）被清除，然后连续过滤，逐步清除较大的细胞碎片和分子。该技术相对简单，且可同时进行Hb的纯化和浓缩。
材料 & 方法
RBCs溶液起始处理量为1,000 mL，离心后，用等渗盐水漂洗去除非细胞性Hb和血浆蛋白，再用PB溶液冰浴裂解RBCs，裂解液终体积为2,000 mL。
仪器使用KrosFlo 研发用IIi 切向流过滤系统和4根不同孔径规格的中空纤维过滤组件：50nm、500kD、100kD和50kD，级联流路如下图所示。组件使用前用去离子水完全浸湿，并进行完整性测试。
在每个过滤阶段，收集滤液，并循环回流液，以提高Hb产量。但在阶段III，1L的PB溶液进行洗滤操作。整个纯化工艺在生物安全柜内进行，滤液及回流液容器置于冰上。每个阶段开始和结束时测量滤液流速和跨膜压，并在各阶段处理结束后，从滤液中取出10mL，做进一步分析。阶段I起始过滤量为2,000 mL RBCs裂解液。每次运行结束后，HF组件、相关软管和容器均用0.5M NaOH溶液清洗，以清除可能粘附到HF膜上的蛋白，并降解可能存在的内毒素。
使用Bradford、紫外可见光谱、质谱等方法对纯化所得的Hb进行质量检测。
结果 & 讨论
由于浓差极化的原因，在Hb纯化的每个阶段，滤液流速和回流液体积都会随时间降低。浓差极化是由于大分子或颗粒积聚在HF膜表面，形成滤饼层，即使在HF膜没有发生物理性堵塞的情况下，滤饼层的形成也会降低分子穿过膜的速率。在前两个阶段，大部分蛋白质通过HF膜，进入滤液容器，而细胞碎片和大分子则浓缩回流，部分细胞碎片会堵塞HF膜孔，提高跨膜压，降低流速。在阶段III，大部分Hb被截留在回流液中，而部分Hb（αβ二聚体）进入滤液。
蛋白浓度分析显示，大部分Hb截留在阶段III（膜MWCO 100kD）的回流液中，浓度约为5mM，显著高于离子交换层析方法（0.7 - 1.7mM），而metHb水平（~ 0.5%）低于离子交换层析方法（0.5% - 2%）。纯化的Hb中，内毒素水平亦低于RBCs原液，内毒素主要为脂多糖（~ 10kD），可在阶段III（100kD HF膜）过滤去除。
SDS-PAGE显示，大多数杂质在阶段I和II即可去除，而在阶段III，通过连续洗滤，可显著降低杂质含量。在平衡氧结合特性分析中，纯化的Hb（100 kD回流液）各测量值均与RBCs接近，说明TFF过程未改变Hb特性。
对阶段III回流液内容物进行质谱检测，结果显示，α、β球蛋白链及其聚合物分子量检测值与理论值保持一致，说明Hb是阶段III回流液中的主要成分。
切向流过滤是一种实用、快速的Hb纯化及浓缩方法，与其它方法相比，所得Hb纯度较高，且metHb水平较低。同时，调整阶段III的洗滤体积，可进一步提高Hb纯度。
仕必纯编译
参考文献
1.Palmer, A.F., et al.. Tangential Flow Filtration ofHemoglobin. Biotechnol. Prog., 2009, Vol. 25, No.1.
2.Elmer, J., et al., Purification of hemoglobin bytangential flow filtration with diafiltration. Biotechnology Progess. 2009,Vol. 5, No.25.
3.Reis, R.V., et al., High-Performance tangentialflow filtration using charged membranes. Journal of Membrane Science. 1999,Vol. 159, No. 1-2.
关于仕必纯（Spectrum Laboratories, Inc.）
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