在cGMP生物生产设施中使用单次使用TFF系统

对于多产品cGMP生产设施，防止产品间交叉污染风险的策略应优先考虑。对于大多数工艺操作，单次使用技术可为达到该目标提供一种简单的方法。本案例研究评估了从多次使用向单次使用切向流过滤（TFF）的转换及其在CMO 公司 – CMC Biologics的500L生产规模重组蛋白生产设施（PF1）的缓冲液置换步骤中的使用。

常规的单克隆抗体（mAb）或重组蛋白生产工艺会使用TFF超滤/洗滤，进行终产物的浓缩和散装原料药的制剂（见图1）。一套TFF系统的主要考量标准包括其cGMP适用性、产品的相容性以及可靠的性能，包括高产量和有效的缓冲液置换。此外，特别是多于CMO，其它的一些标准也同样重要，包括快速且可预测的搭建及操作、具有多种过滤器选择的平台化系统（以适配不同的蛋白质产品）、以及低的总操作成本，包括材料、劳动力、缓冲液使用以及因产品更换产生的管理费用。单次使用技术可很好地满足后几个标准。单次使用系统的一个主要目的是简化并降低与产品更换相关的成本，其可显著减低清洗及清洗验证的要求，因为产物接触表面在使用后即可“抛弃”。此外，对于TFF，通过消除在生产批次间的多个膜清洗及储存步骤，可降低常规使用中的总操作时间（见图1B）。重复使用TFF膜通常是产品针对性的，在生产运行之间，针对不同蛋白质产品的多次使用TFF膜需要大量的储存和追溯管理工作，而单次使用系统可完全消除这些工作。相比重复使用膜，单次使用系统的经济性也受到单次运行中批次较少的中间规模生产的青睐。

图1. 工艺流程图。（A）单克隆抗体或重组蛋白典型的工艺流程。用于缓冲液置换的超滤和洗滤（UF/DF）在生产工艺结尾进行，以进行散装原料药的制剂。（B）使用切向流过滤（TFF）进行UF/DF的工艺步骤。右边所列为使用重复使用和单次使用过滤器时不同的步骤。左边括弧内所示为使用前、后操作的工艺时间。

CMC Biologics的PF1 cGMP生产设施设计用于哺乳动物细胞培养工艺，最高为500L生产规模，基于单次使用技术。有临床阶段蛋白质治疗药物的典型PF1客户，需要在单次生产运行中，进行相对较少的批次（如2-5批）。所以，在对产品更换的频繁需求以及短期运行的经济性利好之间，单次使用TFF系统明显更加适配。过往，为了简化设备调试，单次使用技术最初在上游生产和缓冲液制备中得到了更多的重视，这样，大多数下游纯化操作就可以利用在平行的3000L生产厂房中已经建立的可重复使用系统所含的设备和方法。当PF1设施全面投入运行，就可执行策略性计划，从多次使用操作向单次使用转换，而最终的TFF缓冲液置换步骤成为转换的首选之一。转换的方法简单而直接。首先，使用供应商的描述来确定一套TFF系统，其需最好地满足CMO的要求，然后在三个阶段中进行性能评估：1）证明在规模缩放模型中的适用性；2）规模放大至PF1 生产工艺；3）使用多个批次的过滤器，评估在多次运行中的可靠性。

过滤器选择

对于生产多个生物分子药物的CMO公司，选择单次使用TFF过滤器系统的关键属性是对于cGMP生产的适用性、成本、过滤膜的类型、针对孔径及过滤器面积的全面的产品线、以及可选择完全一次性的流路。Sius单次使用TFF系统可解决所有这些需求，所以选择其用于实验评估。这些单次使用cGMP TFF膜包的成本约为常见重复使用TFF膜包的1/5，但使用与其它过滤器应用中常见的膜化学材质相同的膜类型，且相比传统多次使用过滤器，具有更出色的通量性能。除了标准的mPES膜（Prostream），还为更具挑战性的应用提供一种亲水性更高的mPES膜（Hystream），例如对于极高终蛋白浓度和特别疏水的蛋白质。作为一家具有临床和大规模商品化生产能力的CMO，一个值得注意的点是，供应商应能提供与单次使用产品采用一致的膜的重复使用TFF膜包（膜包构建方法区分单次使用和重复使用系统）。这种完整的可放大性将在产品生命周期的后期提供一种向重复使用过滤器转换的低风险方法，因为，如果蛋白质治疗药物最终需要进行大规模生产，从经济上考虑可能更倾向于重复使用系统。膜孔径范围为1kD – 0.65μm，标准膜包面积范围为0.01-2.5m2。这种完整的产品供应，可提供建立具有内置灵活性的平台TFF工艺的方法，以处理客户不同的蛋白质。对于PF1 设施典型的早期临床项目，快速且经济的工艺开发通常是目标之一，而简单的平台工艺是实现该目标的一种方法。最后，尽管单次使用TFF膜包可兼容传统的膜包夹具，但也可以使用单次使用的导流板，其提供相同类型的卫生连接。可抛弃型的导流板采用USP VI级聚丙烯材料，可避免工艺料液与膜包夹具表面接触，方便产品更换，且无需进行膜包夹具消毒的工艺步骤。

除了过滤器本身，还需要对待评估的系统的其它部件进行决策。由于产品转换考量是在PF1中使用单次使用TFF的关键驱动因素，一套完全由单次使用产品接触表面组成的系统是最终目标，包括产品容器、回流容器、泵头和/或软管、在线传感器以及TFF膜包和导流板。这样一套系统以现有的技术完全可实现，尽管在本评估中，没有使用单次使用传感器，否则即可形成完全一次性的流路。没有使用是为了避免在cGMP背景下引入额外的复杂性，因需要计量，以同时转换到新的传感器技术。随后向完全单次使用产品接触表面的步进式转换相对直接，因为单次使用传感器和单次使用部件使用兼容的接头。纳入额外的单次使用部件会影响TFF操作使用单次使用系统的经济性。之前已经证实，对于过滤器放大至至少3m^2时，仅使用单次使用TFF过滤器（即在重复使用流路中），相比重复使用过滤器，具有成本优势。这一优势覆盖年生产批次的任意数值，但当运行低于约5个批次时，成本优势将显著增加。对于更大的过滤器面积，过滤器成本的影响会比劳动力更加显著，所以，单次使用成本优势特别针对短期的生产运行。当在公式中加入单次使用流路（见图2），总成本增加，但在2-5个批次的典型临床运行中，相比重复使用系统，仍有优势，这也是PF1设施的主要客户。

图2：单次使用流路示例。A）导流板。B）导流板与切向流过滤（TFF）膜包组装后置于无产品接触的不锈钢夹具内。C）一套完全单次使用的流路的示意图，使用生物工艺袋作为回流液容器。注意：PT为单次使用压力传感器，FT为流量传感器，TT为温度传感器，Cd为电导传感器。D）在不同生产批次总数（即多次使用过滤器的使用次数）以及单次使用技术整合至TFF系统的不同程度的条件下，相比使用传统多次使用TFF，使用单次使用TFF的成本节省。仅膜包：Sius单次使用膜包直接替换重复使用膜包，使用标准流路；膜包+PFI：Sius过滤器膜包和单次使用流路连接，替换标准过滤器。完整流路：在进行TFF的整个系统中，所有产品接触表面替换为单次使用部件。单次使用成本节省假设：过滤器成本降低80%、劳动力降低60%、缓冲液/注射用水使用降低75%。当Sius过滤器以预消毒形式提供时，缓冲液使用假定不进行使用前、后的消毒，尽管对于重复使用流路选项，可能需要对特定部件进行消毒处理，即缓冲液使用的节省可能会少一些。

实施

在CMC Biologics，新过滤器使用的方法包括在工艺开发中在小规模条件下进行过滤器评估，之后规模放大至全规模工程运行，然后在cGMP生产中使用。选择Sius作为PF1的候选单次使用TFF过滤器之后，选择单克隆抗体（Mab X）作为初步实验模型（见图3）。Mab X之前使用传统的重复使用TFF过滤器生产，可耐受标准的TFF处理和最终的产品浓缩。它还为工艺参数提供了基线，包括通量和步骤收率。但是，两种过滤器之间的详细比较不是本评估的重点，因为转换到单次使用技术一项战略性决策。结合供应商提供的操作参数，在研发实验室中使用实验室规模的0.01m^2 Sius-LS Prostream mPES TFF膜包，进行了简单的缓冲液置换工艺。产品载量为270g/m^2，这是大多数TFF工艺的典型数值，但已是原始生产工艺的2.5倍，因其使用了过大的过滤器，以加快操作。使用Sius 过滤器进行缓冲液置换，监测电导，匹配预测为零截留系数，这是使用30kD 膜进行低分子量缓冲液成分处理时的预期结果。产品收率较高，为96%，与原始生产工艺相当。产品质量属性，如聚体百分比，也不受TFF操作的影响。Sius的通量稍高，平均为53LMH，而在生产中使用重复使用过滤器时，为46LMH，且前者蛋白质的膜载量更高，而跨膜压（TMP）更低。

图3：使用Mab X的评估。A）工艺比较。在原始PF1生产工艺中使用的重复使用切向流过滤器和在实验室规模及PF1生产规模使用的Sius过滤器的MWCO均为30kD，错流流速为360L/m2/h。工艺的浓缩和洗滤阶段的通量见上图，操作参数见下表。B）使用实验室规模Sius进行缓冲液置换。以在洗滤的不同点的电导测量值与假定缓冲液成分0%截留的理论电导进行绘图。同时显示预测的残留缓冲液%。

然后，Mab X被用于解决工艺规模放大至500L 生产规模工程运行的PF1的第二个目标。产品载量为210g/m^2，低于实验室规模的测试实验，但接近使用重复使用膜的原始工艺的2倍。由于单次使用系统消除了多个使用前、后操作步骤（见图1），节省的时间可补偿在UF/DF中更高的载量所导致的更长的处理时间。单次使用过滤器的通量和产量在实验室规模和GMP生产中相当。同样，产品质量一致。在操作上，在从cGMP生产中，使用系统没有遇到问题，设计与传统多次使用TFF基本相似，操作员仅需稍作培训。

然后使用两个问题蛋白对SiuS TFF膜包进行了进一步的评估，以确定系统是否可为在CMC Biologics进行的不同的客户项目提供一个平台化的缓冲液置换工艺（见图4）。Protein Y是一个较大的多聚蛋白，容易聚集，使用与Mab X相同的膜材料进行评估 – 30kD的Prostream。同样，过滤器先在较小的研发规模下进行测试，在用于cGMP生产前，还在全规模的工程运行的进行测试。两种规模下，性能相似。为降低聚集风险，TFF步骤中的最终目标浓度只稍高于最终药物底物的目标浓度，所以，最终的系统冲洗只能使用极低体积的缓冲液，给产品收获造成了不小的挑战。仅简单地使用供应商提供的条件，即可获得较好的TFF性能，PF1 cGMP生产中基本可定量回收。更重要的是，操作结果显示，聚集没有增加。Protein Z是一个融合蛋白，在研发小组中，评估了最终目标浓度50mg/mL的操作。对于该应用，使用了更加亲水的50kD Hystream mPES膜，其是供应商推荐的用于高蛋白质浓度应用的过滤器。在洗滤过程中，只需要进行较小的工艺优化，即可达到96LMH的平均通量，加快处理时间，这其中包括了在20mg/mL 蛋白质浓度条件下进行了洗滤步骤，错流流速达900LMH，以及最终达到50mg/mLd的浓缩步骤。在缓冲液置换过程中，产品质量可维持。因项目要求发生变化，该高浓度工艺没有进行规模放大。

图4：使用Protein Y和Protein Z的评估。A）PF1中在生产规模的Protein Y的切向流过滤（TFF）。左表所示为工艺参数，右图所示为在浓缩和洗滤中的通量。B）在小规模实验中Protein Z的TFF。右表所示为工艺参数，左图所示为在浓缩和洗滤中的通量、错流流速。

评估的最后阶段是评估在cGMP生产中，全规模工艺的一致性。使用Sius TFF系统作为最终的缓冲液置换技术，进行了6批次的Mab X和5批次的Protein Y生产。数据来源于常规的cGMP操作，作为真实的例子。因此，通量和TMP为在生产批次记录中，周期性手工记录的数据点的简单平均值。该评估的一个目的是确定过滤膜包的批间差是否会成为单次使用系统的一个问题。在Mab X和Protein Y处理运中，总共分别使用了4个和2个不同批次的Sius过滤膜包。产品收率在所有的生产批次间保持高度一致，UF/DF处理时间较快且可预测，在手动操作预期的范围内。

总结

从多次使用向单次使用转变是一个简单且直接的过程，不需要在时间或资源上进行过多的投入。在cGMP生产中使用单次使用传感器，可进一步向完全单次使用流路转变。Sius 单次使用TFF系统可良好用于500L 生产规模CMO生产设施，或典型的中试生产线。与之前使用的传统重复使用过滤器相比，性能相当或稍好，且在cGMP生产中使用非常简单。对批次记录和操作员培训的更改仅限于取消了多个使用前、后操作。结合完全可抛弃的流路，系统可极大地简化产品转换，通过减少工艺步骤数量，减少总操作时间。在典型的临床阶段生产运行，相比多次使用过滤器，仍具经济性优势。

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原文：J. Dunn, T. Wilkie, M LaBreck, et al.,Implementing a Single-Use TFF System in a cGMP Biomanufacturing Facility. BioPharm International, Volume 2012, Issue 2.

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