灌流常见问题
什么是灌流？
灌流是维持细胞培养生物反应器的一种方式，在这个过程中，从反应器内同时移除并补加等体积的培养基，而细胞截留在反应器内。这可提供稳定的新鲜营养物质来源，并恒量去除细胞废物。灌流通常用于获得更高的细胞密度，继而获得相比传统生物反应器批次或补料分批操作更高的单位体积产率。分泌的蛋白质产物，可在去除培养基的过程中，使用微滤方法连续收获，或者选择合适的超滤方法，在去除培养基的过程中，截留在生物反应器内。
对于生产来说，灌流是不是太复杂了？
使用市面上可见的、符合GMP要求的灌流设备，如XCell ATF系统和KML TFF系统，灌流是可行且被接受的生产平台。从1990年起，就有一系列的商业化产品使用基于灌流的工艺进行生产。这些产品包括凝血因子（分别来自Bayer和Wyeth/Pfizer的VIII因子产品Kogenate和ReFacto）、抗体（来自Centocor/J&J的ReoPro、Remicade、Stelera和Simphoni，来自Genzyme的Campath）、酶（Biomarin的Aldurazyme和Naglazyme）以及其它一些产品。
怎么使用灌流来优化我当前的工艺？
高活细胞密度（VCD）、活性和产率可提高产品质量，并通过多种不同的方式影响生产过程，从而达到显著的经济效率。使用细胞培养灌流来优化工艺的一些案例包括：
连续灌流，即同时生产和收获：这包括维持高细胞密度培养（即40-80E6cells/mL及以上）和连续收获产物，一般持续30-90天。其可通过相对较小的生物反应器，提供一致的产品质量和高效的生产。
高密度种子库：使用灌流制备的高密度悬浮培养液，可允许建立具有一致特性的大体积的细胞库，以便更快地进行细胞扩增。灌流可实现以所需的VCD，在对数生产期对这些细胞进行建库，同时维持高活性。
N-1灌流种子生物反应器（用于生产生物反应器的高接种密度）：在生产过程中，这种方法使用灌流在倒数第二个生物反应器内获得高细胞密度，从而为生产生物反应器提供更高细胞密度的接种液。这可节省在生产生物反应器内的培养数天时间，提高年产量，而不会改变最终的生产工艺。
浓缩补料分批：这种工艺使用超滤过滤器，将产品截留在生物反应器内，但仍从细胞悬液中灌流去除代谢废物。这种培养具有与补料分批相似的较短的持续时间，而可达到比传统补料分批高5-10倍的细胞密度和产物滴度。
细胞澄清：在补料分批或浓缩补料分批灌流中，传统上会使用费力的连续离心和深层过滤，来进行收获液的澄清，而使用微滤灌流组件可取消该过程，收获产物。
在生产背景下，这些工艺的每一种都可获得显著的节省。在实际工艺开发过程中，可对这些策略的进行逐一评估，以确定进行灌流时，在工艺和/或固定设备中的成本节省。
我们目前的培养基是用于补料分批的，我可以使用该培养基吗？
是的，很多时候可以，如果客户是灌流的新手，可以在灌流运行的开始阶段，使用其现有的基础培养基。随着细胞密度的增加，可使用现有基础培养基和现有浓缩补料培养基（根据营养物消耗确定浓度）的混合液。通过调节灌流速率可缓和培养基的相对消耗。最终目标是找到培养基消耗和最高灌流速率（根据下游工艺和收获液储存容量、以及细胞分离设备调节）之间的平衡。
什么是理想的葡萄糖浓度？
稳态灌流时的理想葡萄糖浓度应较低。当暴露于过剩的葡萄糖时，细胞可能会有不充分的代谢，这会导致乳酸生产的增加。所以，推荐将残留葡萄糖控制在较低的水平，即0.1-0.5g/L。与补料分批工艺不同，在灌流中，葡萄糖永远不可能被完全消耗，因为从新鲜培养基中会连续补加葡萄糖。但是，在极高细胞密度条件下，培养基中葡萄糖可能不足够。在这种情况下，可进行补充连续葡萄糖进液，增加培养基中的葡萄糖水平，或者提高灌流速率。
哪种叶轮结构是最好的？
虽然大体积的生物反应器推荐使用双叶轮结构，但灌流一般使用与补料分批工艺所用相似的叶轮即可。结合Marine叶轮和Rushton叶轮可能可提供最佳的混合。可进行kLa研究，以确定哪种叶轮结构最适合您的工艺。
我应该使用哪种类型的鼓泡？
对于高密度细胞培养，推荐使用微泡。相比大泡，微泡可形成更小的气泡，小气泡有更高的表面/体积比，从而提高kLa。但是，更小的气泡也更加稳定，从而增加CO2积聚。而且，小气泡“爆炸”时，会释放更多的能量，破坏细胞。
推荐微泡与大泡结合使用，每种利用其各自目的。微泡只用于O2鼓泡（降低通气量），而大泡用于空气或O2，帮助降低CO2积聚。较大气泡的存在可降低微泡形成的泡沫积聚。
我应该使用哪种碱？
与补料分批操作的批次相似，需要使用碱来控制pH。碱的一般选择是碳酸钠（Na2CO3）、碳酸氢钠（NaHCO3）和氢氧化钠（NaOH），但也可以使用其它工艺中使用的碱。碳酸钠较氢氧化钠温和，但它会解离形成更多的碳酸根离子，导致渗透压升高。在高细胞密度下，pCO2和渗透压会加剧。所以，常见的是使用NaOH（如0.3-0.7M），因其不会增加pCO2，与碳酸钠相比，对渗透压的影响也更小。但是，由于它是强碱，所以添加到系统中时，需注意避免造成局部细胞损伤，也就是需要加在搅拌最充分的部位。应该直接加在顶部叶轮之上，以使其能立即消散。
我怎样维持生物反应器工作体积恒定？
为维持生物反应器液位，收获速率应等于预定的灌流速率。为避免液位变化，进样速率应与收获速率相同。
液位可通过多种方式进行控制：
最简单的方法是使收获泵速与进样泵速相等，为所需的灌流速率，通过带双泵头的单个泵就可完成。没有细胞废弃，也没有碱补加时，这种策略工作良好。
另一种方法是使用一个电导探针，检测控制进样泵的反馈回路中的液位。液位探针的信号会确定液位水平。当收获泵去除用过的培养基时，液位水平下降，回路被打破，这会启动进样泵，培养基补加，直到回路恢复。注意，过量的泡沫积聚会导致液位检测不精确。如果可以，调节液位探针的灵敏度，以避免泡沫影响。
基于重量的控制是控制液位最精确的方法。在这种设置中，生物反应器放置在天平（或称量单元）上，后者与泵进行交互，形成反馈回路。这种液位控制回路可以1）使用生物反应器控制回路进行天平与进样泵的交互，或2）天平直接与独立的智能进样泵进行交互。一旦准备开始灌流，只需简单地在生物反应器或智能泵上启动液位控制回路。当收获泵去除培养基，重量下降到确定的设定点时，会触发进样泵，将重量恢复至设定点水平。
什么是理想的细胞特异性灌流速率？
细胞特异性生长速率（CSPR）等于灌流速率/细胞密度。理想的CSPR取决于细胞系和培养基。理想的CSPR应能获得最佳的生长速率和产率。对于初步实验，50-100pL/cell/day可能是合理的起始范围，之后再进行调节，为您的细胞系找到最佳速率。较低的CSPR可用于降低培养基使用，提高滴度。但是，CSPR会影响产物质量，所以需要针对产物质量，确定理想的CSPR。
我怎么确定可支持最高生产速度的最低CSPR？
以0.3-1E6cells/mL的细胞密度接种生物反应器，按批次模式开始培养，当细胞密度达到2-4E6cells/mL时，以0.5-1VVD的速率开始灌流（注意：当细胞仍处于对数生长期时开始灌流非常重要）。
允许细胞对数生长，如至20E6cells/mL，每天监测生长速率，同时步进式提高灌流至2VVD（或更高水平，如果细胞生长开始降低）。
建立对数生长细胞在20E6cells/mL左右的稳态培养，通过每日细胞废弃，抵消细胞生长。
按1-3天的间隔（需要持续时间，以观察所进行的优化的影响），使用下述步骤，确定给定细胞系和培养基的最低CSPR：
按0.5VVD的幅度，提高灌流，根据结果，直到i）或ii）：i.如果生长速率提高（当提高灌流速率），则当前的灌流速率仍过低。重复以0.5VVD的幅度提高灌流速率，直到其进一步的增加不再提高生长。倒数第二个增加值即为最低CSPR。
如果生长速率不提高（当提高灌流速率），则当前的CSPR已足够了，且最低CSPR可能更低。测试按0.2VVD的幅度降低灌流，直到生长速度降低。观察到生长速度降低前的最后一个灌流速率即最低CSPR。（注意：观察到更慢的生长速率之后，可能需要数天进行恢复，因为培养需要从营养限制中恢复）。
注意：一旦确定最低CSPR，推荐对产品质量进行确认。
起始灌流速率应该是多少，我应该怎样以此为基础来增加？
培养通常以批次培养开始。灌流一般在接种后2-3天开始，此时细胞仍处于对数生长期，且未发生营养限制。
灌流开始的天数取决于工艺，会因细胞系、接种细胞密度、细胞生长速率、代谢以及培养基的差异而不同。一种确定开始灌流天数的简单策略是，使用补料分批工艺中第一次补液的时间。推荐在第2-3天开始灌流，以检查/监测灌流设备（如泵、水平控制），并调节设置，如灌流速率。
可以使用不同的方法来增加灌流速率，如增量式（手动）或连续式（自动）。增量式增加由操作员确定，可基于细胞密度或营养物质消耗的生物标志物，如培养基中的葡萄糖。葡萄糖水平是一种合适的培养基中营养物质可用度的标志物，其在生物反应器中的残留浓度可用于调节灌流速率。对于增量式增加，可以0.5或1VVD开始，根据残留葡萄糖浓度或细胞密度，以0.5或1VVD的幅度增加。细胞密度、生长速率和特异性葡萄糖消耗可用于预测残留葡萄糖。对于灌流中的连续增加，可使用生物质探针（如Aber 探针）与收获泵进行交互，这样，灌流速率可根据生物探针确定的细胞密度，按所需的CSPR，线性增加。
什么是以每日罐体积置换（VVD）为测量值的典型灌流速率？
灌流速率取决于细胞密度和培养基。理想情况下，其值应尽量低，以降低对目的产物的稀释，而使收获滴度最大化，同时确保足够的营养物添加和副产物去除速率。灌流工艺一般范围在1VVD-5VVD之间。出于液体操作和培养基成本考虑，应使用较低的灌流速率。当需要达到高细胞密度，降低POI（目的产物）滞留时间时，可能需要使用更高的灌流速率，但会造成下游料液操作更多的挑战。不过，如果你的工艺依赖于高灌流速率，可增加一个独立的含超滤膜的ATF或TFF系统，将缓冲罐内的产物浓缩至更合理的操作体积。
什么是稳态，我怎样达到稳态？
稳态是指细胞密度和生物反应器环境保持相对恒定的状态。可以通过细胞废弃、营养物限制和/或可能的温度降低来达到稳态。在营养物限制会影响产率或改变产物质量时，推荐使用细胞废弃方法。使用灌流系统，进行营养物供给和废物去除，可获得恒定的细胞生长和产率。
什么是理想的稳态细胞密度？
这会因培养基、细胞系和工艺的不同而有差异。通常，1VVD的灌流速率可支持20-30E6cells/mL的细胞密度。增加灌流速率或优化灌流使用的培养基可达到更高的细胞密度。但是，当细胞密度过高时，生物反应器内条件会较难控制（如pCO2、渗透压、泡沫等），所以，推荐达到细胞密度可控且可维持的稳态，同时维持较高的产率。
我怎么进行细胞废弃（Cell Bleeding）？
细胞废弃可简单地从生物反应器内去除细胞。通常可通过导管，使用蠕动泵，按确定的流速进行。软管的选择需仔细筛选：太细时，细胞可能聚集和堵塞，太粗时，细胞则可能沉降。细胞废弃速率可根据生长速率来确定，从而以连续的形式，将细胞密度限制至所需的值。另外，细胞也可每天一次性去除，加入等量培养基，将细胞密度维持在可预测的范围内。
理想情况下，细胞废弃率等于生长速率，以维持稳定的细胞密度。如废弃时需去除较大体积的培养液，且含有高价值的产物，可将废弃液收集至无菌袋，通过过滤或离心方法回收蛋白质，然后再进行下游处理。
我怎样降低起泡？
由于灌流在更高的细胞密度条件下操作，起泡可能成为额外的影响因素。但是，可以使用消泡剂控制起泡。
消泡剂可根据需要（与补料分批相似）通过批量添加手动加入，或者通过泡沫探针自动加入。泡沫探针是一种电导探针，可置于比液位稍高的位置。当液面上的泡沫增加时，泡沫堆上升，直到接触到泡沫探针，形成回路。该回路可用于触发泵，泵补加消泡剂，直到泡沫消散，回路断开。（注意：泡沫探针是一种液位探针，但以相反的方式使用。）
在某些情况下，工艺中不允许使用消泡剂，可通过优化达到有效氧传质或kLa的方式来降低泡沫。与补料分批相似，可对通气机制进行优化，以降低起泡。可通过优化叶轮结构和速度、通过微泡只鼓入O2、优化鼓泡的孔径等方法来进行。注意，如果使用纯O2鼓泡（特别是微泡），需特别关注培养液中的二氧化碳水平。相比大规模培养，小规模培养中的起泡问题更加严重。在大规模培养中，气泡滞留时间和分压随生物反应器高度而增加。
消泡剂会堵塞过滤器膜孔吗？
消泡剂预计会积聚在膜表面，可能会改变膜特性，导致蛋白质的部分截留，也可能导致膜污染，但最终取决于运行的天数。如果检测到污染（通过观察滤液压力），可更换过滤器。
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