质粒DNA的大规模生产
随着DNA疫苗和基因治疗技术的快速发展，对质粒DNA（pDNA）大规模生产的需求不断增加。与蛋白质的情况一样，pDNA生产的工艺开发一般也从实验室规模开始，构建并筛选合适的表达载体和生产宿主，然后进行发酵条件的选择和优化（上游工艺），细胞生长，以及最后的分离和纯化步骤(下游工艺），工艺开发的每个阶段必需良好整合和衔接，而不是各自独立进行。生物制品的下游工艺通常料液中杂质和污染物的影响，而后者又取决于上游处理和发酵条件。
制定上游工艺和发酵阶段计划时的目的是设计、选择并优化合适的质粒载体，以实现稳定、超螺旋pDNA的大量生产。在这些阶段，必需考虑临床用载体的安全性和效力要求，以及pDNA大规模生产和纯化本身的要求。质粒载体和宿主菌株的“明智”选择，结合生长条件的优化（培养基和条件），可有效地提高质粒产量，降低细胞裂解时的RNA含量。
质粒DNA工艺开发的3个阶段 (G.N.M.Ferreira, et al.,2000)
质粒通常在重组的大肠杆菌（E.coli）中发酵生产，约占E.Coli提取物的3%（w/w）。在小规模时，pDNA的生产和纯化相对比较简单。但在未经优化的实验室条件下进行小规模生产时，所获得的体积滴度通常极低。而在制药水平，pDNA的大规模生产，每批次可能超过50g。在极端情况下，每年可能需要数公斤的pDNA，以满足当前DNA疫苗临床试验的最终市场需求。
pDNA疫苗工业化开发的工艺步骤(A. Ghanem, et al., 2013)
而对于下游纯化，由于目的产物不稳定，生物制品的分离和纯化从技术上讲，都存在不小的挑战，也就意味着需要使用温和的工艺条件。pDNA的纯化与生物样品的传统纯化存在相同的问题，这与pDNA的结构特点有关，包括大小、形状和构型、裂解液和工艺料液的流变特性（如粘度），此外，还包括pDNA提取物中存在的生物分子的多样性，以及pDNA和杂质之间的结构和化学相似性。这些都是优化和建立新的纯化程序的主要挑战。
进一步讲，纯化步骤中的大多数关键污染物具有与pDNA相似的特性，如负电荷（RNA、基因组DNA、内毒素）、相同的大小（基因组DNA、内毒素）以及疏水性（内毒素）。此外，pDNA提取、分离、纯化和制剂中工艺步骤的数量和复杂性还会诱导一种结构性应激，导致超螺旋质粒亚型分子的损坏。
目前，pDNA的纯化工艺一般由发酵步骤后的多个单元操作组成，包括细胞收获、裂解、细胞碎片/固体分离、亲和沉淀、吸附、缓冲液置换以及精制/澄清和浓缩步骤，最后获得适合免疫治疗应用的pDNA。总体来讲，这是一个捕获、浓缩和纯化超螺旋pDNA的过程，如前所述，其只占E.Coli裂解液的3%。该过程必需具有较高的通量，以避免产物降解，同时实现产品收获最大化。为达到此目的，pDNA纯化工艺可分为三个主要过程：初步分离、中间体收获和最终纯化。
质粒DNA下游工艺的常规工艺流程(A. Ghanem, et al., 2013)
超螺旋pDNA的传统纯化最初是一种分子生物学程序，实验室研究是终产品的唯一目的应用。pDNA纯化的标准分子生物学方法包括蔗糖或氯化铯溴化乙锭密度梯度超速离心。但是，这些方法面临两难的问题，例如工艺非常耗时，也难规模放大。所以，其不适合临床应用的质粒的纯化。用于超螺旋pDNA的分析和制备规模纯化的标准实验室和临床生产方法见下表。
pDNA实验室规模和生产规模所用方法比较(A. Ghanem, et al., 2013)
大规模pDNA纯化步骤。列出了每个重要步骤可选的技术及其进行规模放大时可能面临的挑战 (A. Ghanem, et al., 2013)。
在从E.Coli发酵液获得pDNA的工艺流程中，中空纤维切向流过滤（TFF）可在其多个步骤中使用，包括菌体的收获以及pDNA的纯化、浓缩以及换液。TFF可高效地用于菌体收获，相比离心，其利用连续运行，省去了繁琐的人工操作，更适合大体积料液的处理。TFF是从碱裂解液中收获pDNA的有效技术，因其具有可放大、经济、高选择性的优势。TFF利用pDNA与裂解液中分子（如蛋白质、内毒素以及低分子量的RNA）的大小差异来实现pDNA的预纯化，同时由于其开放式流道的低剪切特定，可维持pDNA的完整性和超螺旋结构。此外，TFF同样适用于pDNA的浓缩和换液，以方便随后的层析或制剂步骤。
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原文：
A.Ghanem, R. Healey, F.G.Adly, Current trends in separation of plasmid DNA vaccines: A review. Analytica Chimica Acta, 2013, 760:1-15.
G.N.M.Ferreira, G.A.Monteiro, D.M.F.Prazeres, et al., Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. TIBTECH SEPTEMBER 2000,18:380-388.