自动化小规模平行层析筛选
近年来，对生物药产品——特别是单克隆抗体（mAb）——的需求快速增加。生物药公司对“第一个上市（first to market）”的追求以及降低开发成本的压力，使高通量技术和工具成为下游工艺开发不可或缺的选择。
参考原文介绍了自动化平行层析是如何加速填料筛选、方法开发、工艺分析以及蛋白质药物筛选的开发和优化的。
自动化平行层析
结合Repligen的RoboColumn 96柱阵列和商业化的液体操作工作站，实验实现了全自动化的平行柱层析。RoboColumn的设计允许用户选择任意的层析填料，按每种材料的要求进行装柱。两个过滤器筛板之间的柱床空间可确保高效和峰对称性，与制备和工艺规模分离柱相似。
微型化柱系统采用标准的微孔板形式，含有可替换的阵列，最多可安装96根独立的迷你柱，使用经改进的Tecan Freedom EVO商业化液体操作工作站进行自动化操作。为实现此目的，将机器人工作站的8通道液体递送系统连接到层析柱，以在分离程序的不同步骤中吸取并上样不同的样品和缓冲溶液。
层析柱内（层析柱体积可达0.6mL）的液体流动以正压液体置换驱动，以模拟层析柱单独连接至单通道、独立式层析系统时柱内的状态。步骤洗脱的馏分收集至标准的微孔板，使用自动化微孔板传输系统，送入读板器分析（Tecan开发的Te-Chrom穿梭器），或者转移至其它系统，如紫外（UV）分析、质谱（MS）、酶联免疫分析（ELISA）、高效液相系统（HPLC）或SDS-PAGE。
Tecan的液体操作系统配置可实现蛋白质样品的自动化高通量、小规模生物层析分析，其应用已被成功用于治疗性蛋白生产工艺开发中的参数阐释和优化、用于mAb生产的发酵液的工艺内监测以及抗体筛选中用于质谱分析的样品制备。
RoboColumn设计将合适尺寸的氟橡胶O型圈置于层析柱的顶部，形成密封的进样端口，将层析柱连接至液体递送系统的固定探针。RoboColumn进样端口具有良好的稳定性，确认可耐受不锈钢固定探针上千次的重复插入和移出，不形成泄漏。
层析柱通过注射形成技术，采用聚丙烯材质，具有固定柱床高度。对于每组实验，8根层析柱分别装填所需的层析填料。装柱后的RoboColumn以8根为一组，安装到兼容标准96孔板的基础板上，然后安装到Tecan机器人工作站内专门的板架上。
使用工作站的8通道液体操作臂，在相继的递送步骤中，将单独控制流速的溶质（缓冲液、样品）同时加到层析柱，以进行层析分离。馏分收集到微孔板，在系统整合的读板器内自动评估分析。
A）三步mAb纯化平台。B）在8种不同AIEC填料上，protein A捕获步骤洗脱液的洗脱图形。使用流穿模式操作时，Toyopearl SuperQ-650 M显示最低的蛋白质结合。C）通过调节LOAD和PLW缓冲液的浓度和pH，对protein A捕获步骤洗脱液在Toyopearl SuperQ-650 M上的洗脱图形进行优化。使用以下缓冲液可获得最佳的结果：20mM PBS、80 mM NaCl、pH 6.5（J.Friedle）。
下游工艺开发
mAb的纯化一般为基于以protein A为捕获步骤的平台技术，包括后续的中间体纯化和精制步骤。
通常以阴离子交换（AIE）层析作为中间体纯化步骤，以流穿层析模式运行 – 结合杂质，纯化的目的抗体通过层析柱 – 其具有多个主要优势，包括更小的柱体积、更少的工艺相关溶剂和资源的消耗以及最重要的——不会造成高浓度纯化目的抗体的稀释。
针对此目的，进行了筛选实验，将protein A捕获步骤的洗脱液，在非结合条件下，上样至8排的RoboColumn 5mm ID x 2.5mm H（CV=50μL），装填8种不同的AIE层析介质，然后进行PLW（上样后漂洗）和STRIP（解吸附）步骤。选择在STRIP馏分中显示出最低蛋白质浓度的AIEC介质作为最适合的候选物，然后通过调节LOAD和PLW缓冲液的盐浓度和pH，优化蛋白质结合。最后，在装填Toyopearl SuperQ-65 M的10mL MiniChrom层析柱上，对中间体AIEC步骤进行规模放大。蛋白质收率可达到98%。
工艺内生物反应器监测的工艺流程（J.Friedle）。
工艺分析
所有生物生产的活性药物成分需要在每个生产运行后进行确认 —— 这一点非常重要，因为产物的完整性需与已注册的产品一致。例如，在mAb的案例中，需要对重链、轻链和糖基化的模式需与已注册的标准进行比较。这可在脱盐后，对经过滤的培养液上清进行质谱分析来完成。这里的限速步骤是脱盐，而将重力液流转换为使用RoboColumn的液体操作系统，其时间可缩短10倍。另一个应用领域是找到mAb发酵的最佳收获点，可在接种后第11天取样，过滤后上清液中的mAb结合至与主生产中所用的相同的protein A填料，漂洗掉宿主细胞蛋白，洗脱mAb，并以CIE-HPLC进行分析。获得的图形可用于确定发酵液的收获时间点，以获得最佳的目的mAb产量。
A）CIEX-HPLC后的色谱图，显示mAb单体和mAb聚体的比例以及修饰。当修饰增加时，产量降低。B）A图的放大（J.Friedle）。
总结
将Repligen的RoboColumn 96柱阵列与Tecan的Freedom EVO机器人工作站结合，可显著降低生物药生产的开发时间，从而克服工艺开发的瓶颈。一些自动化筛选程序已被证实可节省80%的项目时间，以及高达35%的人工。
实验成功实现了从常见的单通道、独立层析系统向全自动化、平行层析系统的转换。使用生物层析的小规模自动化高通量分离已成功应用于重组单克隆抗体的细胞培养上清液的筛选，包括研发和全规模生产。
使用重力柱进行蛋白质样品（mAb）脱盐的耗时工艺被有效替换成了由机器人操作的 RoboColumn自动化高通量层析。每个样品的工艺时间可降低约10倍。此外，由于节省了工艺时间、活性药物成分（API）、工艺相关产品和溶剂的用量，还可显著降低每个实验的成本。
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本文节选自以下文章，因水平有限，如有不当之处，敬请谅解。完整的详细内容，请参考原文。
参考原文：J.Friedle, T.Schroeder, Automated Samll-Scale Parallel Biochromatography. Innovations in Pharmaceutical Technology:28-30.
OPUS® RoboColumn®设计与机器人液体操作程序协作，实现全自动化的平行层析。
可多达96柱的RoboColumn®（每行8柱）可根据应用要求，独立排列与96孔阵列板。所含的填料在两个过滤器筛板之间形成柱床，根据填料压缩要求进行验证，以确保高效、良好对称性以及稳定的层析性能。
预装用户所选层析填料
一致的装填，正确的轴向压缩
可以液体处理工作站配速控制的线性流速操作
恒定的保留时间，经证实的规模放大和规模缩小
每次可处理大量样品，实现多重通道
使用机器人液体操作工作站平行操作OPUS® RoboColumn®，进行层析“实验设计”（DOE）和QbD（质量源于设计），可显著缩短工艺开发时间。
OPUS® RoboColumn®与Tecan和PerkinElmer平台均兼容，自动化操作优选Tecan Freedom EVO® 机器人工作站。
同时自动步骤-梯度洗脱至96孔板
在整合的读板机内进行后续分析
灵活的软件向导程序
结合OPUS® RoboColumn®和Tecan Freedom EVO® 机器人工作站，可获得完全整合的平台，实现最顶级的小规模蛋白质纯化。