重组AAV的大规模纯化

重组腺相关病毒（rAAV）是一种非常有吸引力的工具，已作为通用的基因递送载体，用于基因治疗。尽管rAAV可安全地将治疗性基因转移至体内分裂或非分裂的细胞，但rAAV生产的传统方法面临着诸多挑战。为了将载体有效地用于体内基因转导，rAAV终产物需含有最低限度的杂质及空颗粒。基于此，需要适于大规模生产的、简单的纯化工艺。但是从转染的人胚胎肾源性293（HEK293）细胞的细胞裂解液中收获和纯化rAAV的传统方法往往涉及多个繁琐的步骤，且使用氯化铯（CsCl）或碘二甲醇密度梯度超速离心的方法不适于大规模生产。所以要开发替代方法，以将rAAV用于临床实践。

基于过滤和层析的技术路线可规模放大。已有诸多类似纯化方案的报导，大多数使用离子交换和亲和层析。亲和层析技术较难从空颗粒中分离病毒基因组的颗粒。而由于在有或没有载体基因组存在的条件下，病毒颗粒（衣壳蛋白）的等电点会有不同，所以，离子交换层析是一种有效的替代方法。之前有报导，使用双离子交换层析柱配置（阳离子/阴离子交换）层析，可有效地分离病毒基因组颗粒。此外，基于rAAV血清型1（rAAV1）的分子粒径，还可使用体积排阻层析（凝胶过滤）。

相比其它血清型，rAAV1可更有效地转导骨骼肌，被认为是非常有前景的治疗性载体。此外，第一个获批的基于rAAV的药物，Glybera ，即以rAAV1生产。在此研究中，科研人员尝试使用过滤和层析方法（双离子交换和凝胶过滤层析），从无血清培养上清液中生产和纯化rAAV1，以避免超速离心纯化相关的缺陷。

不含超速离心步骤的重组腺相关病毒血清型1（rAAV1）生产和纯化程序。三个质粒（cis-AAV质粒（带AAV-2型反向终端重复子）、trans-质粒（带AAV-2型Rep基因和1型Cap基因）及腺病毒辅助质粒（带腺病毒基因组的基本区域））使用PEI转染至无血清培养基中的HEK293细胞。转染120hr后，收获培养上清液，以0.45μm过滤器过滤。之后，使用配有中空纤维柱的KrosFlo Research IIi 切向流过滤系统进行切向流超滤并浓缩10倍。使用1/3-饱和的硫酸铵（AS）沉淀，降低蛋白质碎片的含量，rAAV1最终沉淀于1/2饱和的AS溶液中（1/3→1/2 AS）。然后在低盐缓冲液（含5mmol/L NaCl）中透析，并吸附至离子交换膜。最后，从阴离子交换柱上洗脱的rAAV1用凝胶过滤层析纯化（T.Tomono, et al., 2016）。

对获得的终产物进行分析，结果显示，纯化的rAAV1在SDS-PAGE中呈现3根清楚的条带（81.4kD的VP1、66.2kD的VP2和59.6kD的VP3），而根据负染电镜分析，90%的rAAV1含有完全包装的病毒基因组。从4x10^9HEK293细胞获得的纯化rAAV1基因组滴度为3.63x10^13v.g./ml。 

rAAV1终产物以5-20%梯度SDS-PAGE凝胶（左）、Western Blotting（中）及电镜分析（T.Tomono, et al., 2016）。

这种新的方法生产了高纯度的载体，使用化学限定培养基、TFF和膜层析等技术，可支持工艺的放大，并确保安全的临床研究。这种适用于分泌至无血清培养基的rAAV1的纯化方法，适用于分泌至悬浮培养系统中无血清培养基的rAAV1。静脉注射时，CsCl对小鼠的LD50为910μg/g，所以，无CsCl、无超离的方法从毒性角度考虑，更加安全，更适于rAAV1的临床使用。这种“流线型”纯化方案有助于未来的临床研究。

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参考原文：

• T.Tomono, Y.Hirai, H.Okada, et al., Ulrecentrifugation-free chromatography-mediated large-scale purification of recombinant adeno-associated virus serotype 1(rAAV1). Molecular Therapy - Methold & Clinical Development, 2016, 3:15058.

• M.Penaud-Budloo, A.Fracncois, N.Clement, et al., Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production. Molecular Therapy: Methods & Clinical Developemt, 2018, 8: 166-180.

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