病毒类生物制品的连续生产
与批次和补料分批培养不同，连续细胞培养通过补充新鲜培养基，同时去除耗竭培养基，维持生物反应器内恒定的体积，通常可达到极高的细胞密度，这就意味着培养基灌流速率高于细胞生产速率，细胞需被截留在生物反应器内。目前市面上有不同类型的细胞截留装置。但是，最常使用的是切向流过滤（TFF）或交替式切向流（ATF）。
早在80年代后期和90年代初，连续培养已被考虑用于生物制药，彼时，连续生产主要用于生产不稳定的蛋白质。但随着对生物药需求的增加以及市场竞争的加剧，行业开始寻求更高效、更灵活的工艺和设施。为解决这种新的挑战，制药行业开始重新审视连续培养作为一种解决方案的可能性。
使用配置交替式切向流（ATF）过滤的搅拌罐生物反应器进行灌流培养，以进行病毒颗粒连续生产时的反应器配置（S.Gutierrez-Granados, et al. 2018）。
尽管连续培养的操作更加复杂，但与批次和补料分批相比，其优势也非常明显。连续补加培养基可获得更高的细胞密度。与此同时，可能会影响细胞生长或蛋白质生产的代谢副产物被连续去除。这通常可转化成更高的单位体积产量，相应地降低生物反应器尺寸、降低生产线占地以及成本投入，而生产批次的大小由操作时间决定，而不是生物反应器的大小。产物可连续收获，这对于不稳定的蛋白质来说是一项明显的优势，因如其在生物反应器滞留时间过长，可能因为培养的条件，而损失其质量属性。总体来说，相比其它培养模式，连续培养可强化工艺，增强操作的灵活性，而降低成本。
过去一段时间，连续培养在蛋白质和单克隆抗体生产上的应用已经得到了很大的发展，而参考原文关注了使用连续培养进行病毒（疫苗和病毒载体）的生产，以及这种培养模式怎样操作和优化，以提高基于细胞培养的病毒性产物的产量和质量。
病毒性疫苗的连续生产
基于细胞培养的病毒性疫苗包括相对“经典”的减毒和灭活病毒以及新一代的非感染性病毒样颗粒（VLP）。这种多样性也反映在其生产方法：一些疫苗通过感染宿主细胞生产，而另一些使用稳定或瞬时异源性蛋白质表达方法生产。不管哪种方法，都需要克服相应的生产挑战，包括提高滴度、获得更加经济的工艺，以及保证产物质量，后者会直接影响疫苗免疫源性和安全性。
常见生产方式（瞬时转染、病毒感染及稳定细胞系）示意图（S.Gutierrez-Granados, et al. 2018）。
连续培养为基于细胞的病毒性疫苗生产工艺的优化提供了解决方案。已有关于不同连续培养方法的报导。
用于疫苗生产的灌流培养
与重组蛋白和单克隆抗体不同的是，病毒结构的复杂性妨碍了宿主细胞生产大量病毒的能力，所以，细胞特异性病毒产率通常较低。出于此原因，为细胞连续提供新鲜的营养物质，同时去除代谢副产物，有助于提高细胞所能生产的病毒数量。Nikolay等在批次摇瓶中以BHK-21悬浮细胞生产寨卡病毒，比使用贴壁Vero细胞的标准生产，产率要低（9x10^3 PFU/mL vs. ~10^7PFU/mL）。为提高滴度，作者使用ATF系统进行了灌流培养。感染前，通过将灌流速率从0.15VVD提升至0.42VVD，细胞生长至12x10^6cells/mL。感染后，灌流维持6天，达到3.9x10^7PFU/mL的生产结果。尽管相比贴壁细胞培养，悬浮细胞的特异性病毒产率仍较低，但是建立了一种用于寨卡病毒的产量足够的可放大生产工艺。
Cervera等开发了一种可强化人免疫缺陷病毒（HIV）VLP生产的新方法，使用重复瞬时转染和培养基置换的HEK293细胞培养，命名为Extended Gene Expression（EGE）。转染后，每48小时置换培养基，相比72小时的批次培养，蛋白质生产可提高8倍。而结合两次再转染，可提高12倍。在配有灌流的1.3L生物反应器上成功操作了这种方法，以0.5VVD的速率置换培养基，使用连续灌流，细胞可生长至更高的细胞密度（~16x10^6cells/mL），高于使用不连续培养基置换的摇瓶培养，同时维持VLP滴度。所以，EGE是一种可强化瞬时转染工艺的非常有潜力的策略，可进一步优化以获得更高的VLP滴度。
Fontana等使用稳定的HEK293细胞系生产了狂犬病毒样颗粒。作者使用5L生物反应器，以灌流模式，培养细胞20天，使用旋转滤器截留细胞。使用这种方法，培养密度可达到16x10^6cells/mL，相比批次模式，细胞密度翻倍。由于基于VLP的疫苗可稳定生产，生物反应器内细胞越多，即直接意味着可生产更多的产物。这可降低生产工艺的成本，进而显著影响动物疫苗的生产。
通过灌流克服细胞密度效应
细胞密度效应是一种广泛报导的现象，即细胞在高密度（0.5-5x10^6cells/mL以上，取决于每种特定的细胞系）条件下感染或转染时，细胞特异性产率会显著降低。造成这种现象的主要假设是在高密度条件下，营养物质被“剥夺”，在此类条件下，细胞很难生产高病毒滴度。灌流已被证实有助于客服“细胞密度效应”的限制：以灌流模式培养的细胞在更高的细胞密度条件下被感染或转染，可维持细胞特异性产率。
Genzel等通过感染AGE和CAP细胞生产流感病毒，以ATF系统进行灌流。AGE细胞在50x10^6cells/mL条件下感染，CAP细胞在25x10^6cells/mL条件下感染，相比低细胞密度感染，两种情况均可维持特异性病毒产率，明显克服了细胞密度效应。Petiot等报导感染使用声学过滤器灌流培养的HEK293细胞，生产流感病毒。HEK293细胞在灌流中呈现中更加活跃的代谢状态，从而使滴度增加10倍。Venereo-Sanchez等使用生产血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的可诱导细胞系生产基于VLP的流感疫苗，瞬时转染Gag-GFP作为VLP的核蛋白。通过灌流培养HEK293细胞，以在诱导HA和NA表达及Gag转染前，达到高细胞密度（14x10^6cells/mL）。由于特异性病毒产量不受影响，相比批次培养，灌流培养的Gag-GFP和HA滴度分别增加了60倍和17倍。
病毒性疫苗的连续收获
基于病毒的疫苗滴度也会受到收获时间的影响。病毒通常对生物反应器内的理化状态较为敏感，如果滞留时间过长，可能会影响其感染性。出于这个原因，如果病毒可被连续收获，即可被立即处理或储存于适合的条件下，以维持其特性。Petiot等对不同温度条件下的流感病毒的稳定性进行了研究，观察到，如果生产在35℃条件下进行，且病毒连续收获，并储存于2-8℃，灭活率会显著低于在37℃条件下进行的更长时间的培养。此外，细胞培养基的连续去除可避免细胞副产物（宿主细胞DNA和蛋白质）的累积，有利于病毒特性的保持，也可简化下游工艺。
用于疫苗生产的其它类型的连续培养
两阶段连续生物反应器是以连续模式生产病毒的另一种替代方法。该系统由物理性分离的两个串联生物反应器组成，一个用于细胞生长，一个用于病毒生产阶段。详细介绍，请参考原文。
病毒载体的连续生产
尽管过去几年对病毒载体的兴趣在不断增加，但对生产工艺的关注却不多。需要开发高效、可放大、稳健且可重复的生产工艺，以满足基因治疗行业对病毒载体不断增加的需求，同时保证合理的成本。最常使用的系统仍然是批次或补料分批，且多数基于贴壁细胞。但是，为克服这些策略的限制，灌流受到了越来越多的关注。病毒载体可通过感染、瞬时转染或生产细胞系生产。使用灌流培养模式的不同系统已有文献报导。详细介绍，请参考原文。
使用悬浮细胞的病毒载体灌流生产
慢病毒载体
慢病毒的半衰期为4-16小时，所以对于其生产来说，批次或补料分批不是非常有吸引力的选择。“假”灌流可用于慢病毒的小规模生产，将转染时的细胞密度从1x10^6cells/mL提升到5x10^6cells/mL，同时维持2TU/cell的恒定产率。转染前后，以1RV/day的置换量，离心置换培养基。该方法转移至生物反应器规模时，转染后进行灌流，可收获慢病毒，去除残留的转染复合物，并为转染的细胞提供额外的营养物质。
最近，Manceur等使用可诱导HEK293生产细胞系，生产慢病毒载体。实验测试了两个不同的灌流策略。在第一种策略中，在整个生物工艺过程中（诱导前/后）使用基础商业培养基进行灌流。在第二种策略中，使用强化的培养基达到目标高细胞密度，并在诱导后开始灌流模式。使用灌流策略，病毒滴度达到8x10^10TU/L，是批次模式的15倍。
逆转录病毒载体
灌流也被用于逆转录病毒的生产，使用悬浮驯化的293GPG包装细胞。使用3L生物反应器灌流培养，结果显示，相比批次模式，莫洛尼小鼠白血病病毒（MoMLV）病毒颗粒滴度增加2倍（2.3x10^7IVP/mL）。Grieger等测试了从悬浮培养基中连续收获rAAV的方法，相比批次对照组，AAV8和AAV9分别增加了6.5倍和4.8倍。
腺病毒载体
腺病毒载体生产时，如以批次模式进行，在高细胞浓度条件下，会观察到细胞密度效应。已经研究过不同的方法，以规避这个问题，例如在转染前后置换培养基以及通过补料分批优化批次结果。但灌流是克服腺病毒生产中细胞密度效应的最可行的策略。在用于重组腺病毒的293S细胞培养中，为提高细胞密度，使用TFF设备，以灌流模式进行了腺病毒的生产。在1VVD的灌流速率条件下，10天内，293S细胞生长至14x10^6cells/mL。用于腺病毒生产时，三个293细胞培养以1VVD的灌流速率，平行进行，在平均密度8x10^6cells/mL时感染，即相当于对数生长中期。一个培养设置为37℃，另两个设置为35℃。结果是，在37℃条件下，可生产3.2x10^9感染性病毒颗粒（IVP）/mL，在35℃条件下为7.8x10^9IVP/mL，至少是批次对照组的5.5倍。
ATF灌流设备也被测试用于溶瘤性腺病毒载体（ONYX-411）的生产，使用HeLaS3细胞系。生物反应器以批次模式开始，当乳酸浓度超过1.3g/L时，开始灌流。补液策略基于维持葡萄糖浓度高于2g/L，且乳酸浓度低于2g/L。每天两次检查灌流速率，以满足细胞培养要求。培养感染后，停止灌流3小时，以避免“洗掉”用于感染的病毒。结果显示，补料分批和灌流培养的平均细胞特异性病毒产率相当，分别为3.1x10^4VP/cell和3.3x10^4VP/cell。但是收获时，灌流培养中检测到的平均病毒滴度约为补料分批培养的4倍，因为在感染时，活细胞密度差为4倍。
总结和展望
随着新一代基因治疗临床试验数量的增加，以及新的、基于细胞的疫苗的不断发展，在未来的一段时间内，病毒颗粒生产技术还将继续其革新，以作为向患者有效、安全地提供新型治疗方法的关键部分。为满足这方面的预期，必需面对一些挑战。首先，需要降低生产的成本，以使工艺更具经济性，更有行业竞争力，以获得患者“负担得起”的治疗方式。其次，需要建立更加灵活的生产设施，以满足更加多样化的管线的要求。一方面，建立针对可能的、新病毒的爆发的快速反应，生产所需的疫苗，是必然的要求。而另一方面，药物也在向更加个体化的方向发展，待治疗的患者群体更小，治疗更加“精准”。这也就意味着未来的生产设施需具有生产多个药物的能力，而每个的生产量则可能会降低。新技术的发展需能相应这些挑战。
生物制药行业的生产模式的转变正在发生，批次和补料分批模式正逐渐被连续生产取代。使用连续技术获得的病毒颗粒生产的成功案例、新的监测和控制技术的发展以及连续下游工艺的整合，将极大的促进连续平台的巩固，以用于作为治疗性药物的病毒的生产和纯化。
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参考原文：
S.Gutierrez-Granados, F.Godia, L.Cervera, Continuous manufacturing of viral particles. Current Opinion In Chemical Engineering. 2018, 22: 107-114.