灌流工艺的开发：关键质量属性的调控

在灌流操作中，除了对反应器环境，即进、出液流速，的可靠控制外，在极高的细胞密度条件下，还会出现多种工程挑战，如搅拌、通气、pH控制以及细胞聚集，其它的一些主要限制因素还包括所生产分子的特性，其又包括蛋白质的最大可允许滞留时间（其会限制反应器体积和灌流速率之间的比例）、最大的收获速率（受细胞截留设备的限制）、最高的细胞密度（受包括氧气供应等因素的限制）以及最低CSPR（受培养基配方及其维持细胞存活的能力的限制）。

关键质量属性

灌流操作的主要优势，可能在于与所生产蛋白质的质量属性。蛋白质相关的属性，如翻译后修饰（PTM），被认为是关键质量属性（CQA）。糖基化或电荷亚型是可影响药代动力学（PK）和蛋白质理化特性的质量属性的两个例子。目前，生物仿制药的开发极大地挑战了这些属性控制的方式，因为需要对质量进行“调节”，以与原研药一致。相应的，用于严格调节并控制这些属性的技术也是必需的。

在非连续系统中，如批次或补料分批，产物被截留在毒素和反应副产物不断累积的环境中，这两者会影响质量属性。连续变化的环境会导致不同蛋白质亚型的表达，而终产物是在整个运行过程中的不同时间点所生产的所有蛋白质的总和。所以，会呈现出异质性较大的产物质量分布。对补料分批中的多个参数的研究，已经确定了可用于调控这些参数的杠杆。Villiger等研究了补料分批系统中N链糖基化的时间性演变，以观察所生产的糖型的变化趋势。基于此，同时结合使用已知可影响特定糖基化模式的特定补充物，他们确定了一种针对这些补充物的特殊补液策略，以形成与补料分批整体相同的糖基化模式。这可显著降低终产物的异质性，获得更窄的分布。

在灌流工艺中，整个生产阶段可维持为一个恒定的环境，反应器内所有过程的动力学特性不随时间改变，包括与杂质或翻译后修饰相关的过程。相应地，反应器总是生产相同的产物，不累积补料分批中的影响因素，从而获得更加均匀的分布。Karst等研究显示，在灌流生物反应器的恒定环境中，所生产的mAb的糖基化特性随时间保持恒定。在此研究中，他们还研究了锰、半乳糖和VCD对N-链糖基化的影响，结果与预期相符。而在另一个研究中，检测了温度降低对灌流系统内红细胞生成素糖基化的影响。这些结果证实，灌流系统的潜力不仅在于生产更加均一的、亚型分布更窄的产物，还可将质量属性调控为所需的特定的目标状态。

另一个批次和连续反应器之间的根本性差别在于滞留时间分布。在批次系统中，产物从其形成一刻到操作结束，一直保留在反应器内，而环境会发生变化，代谢废物累积，同时由于细胞死亡，释放细胞性内容物。相应地，蛋白质会经历多种翻译后修饰，包括氧化、脱酰胺、聚集以及其它过程，可能会形成不需要的物质。在搅拌均匀的连续反应器内，保留时间分布则窄得多，几乎没有蛋白质保留在生物反应器内的时间超过平均值的2-3倍，这可明显降低聚体以及所有上述不希望产生的物质的形成。

此外，还需要考虑工艺相关的杂质，如DNA、HCP、原材料来源的杂质或甚至是污染物。在补料分批中，大部分这些杂质会在运行过程中累积，必需在下游纯化过程中去除。灌流系统的连续培养基置换可防止此类物质的累积，这也是该工艺的另一项优势。

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参考原文：J.Bielser, M.Wolf, J.Souquet, et al., Perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing - A critical review. Biotechnology Advances, 2018, 36:1328-1340.

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