病毒类生物制品生产中的切向流过滤应用案例
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来自日本长崎大学的科学家们在2018年9月的《Journal of Virology》杂志上发表了题为“Envelope-modified tetravalent dengue virus-like particle vaccine: implication for flavivirus vaccine design”的文章。
文中，VLP使用Freestyle 293F细胞生产，以表达VLP的质粒进行转染，并于转染后四天收获细胞培养上清液，离心结合0.45μm过滤澄清，再使用配有mPES MidiKros 中空纤维切向流过滤组件的KrosFlo Research IIi TFF系统对培养上清液进行浓缩，并换液至2.5mM磷酸盐缓冲液。然后，使用离子交换和捕获层析纯化。最后，含VLP的层析洗脱液超滤离心浓缩，并以0.2μm膜过滤。
摘要：登革热病毒（DENV）每年感染5000万-1亿人。DENV相关感染的传播是全球范围内最严重的公共卫生问题之一，因为目前还没有针对DENV感染的可广泛使用的疫苗或特异性治疗方法。为解决这个问题，通过共表达前体膜（prM）和囊膜（E）蛋白，我们制备了重组DENV 1-4病毒样颗粒（VLP），且在E的融合环结构中形成F108A突变，以提高在哺乳动物细胞中的VLP生产。以DENV 1-4 VLP作为单体、单价疫苗免疫，可在小鼠内诱导针对每种DENV血清型的较强的中和活性。当以四价疫苗免疫时，DENV 1-4 VLP可同时诱导针对四种血清型的高水平的中和活性。VLP诱导的中和抗体反应显著高于DNA或重组E蛋白免疫。此外，在以1:10血清稀释时，没有观察到针对任何血清型的抗体-依赖性增强（ADE）。我们也证实，通过在寨卡病毒（ZIKV）囊膜蛋白中引入相同的F108A突变，可增强ZIKV VLP的生产水平。综上所述，这些结果表明，我们用于DENV VLP生产的策略同样适用于其它黄病毒VLP疫苗的开发，因为它们在病毒结构上存在相似性，所以，该策略是开发针对流行性黄病毒的有效四价疫苗的非常有前景的工具。
原文：A.Urakami, M.M.N.Tun, M.L.Moi, et al., Envelope-modified tetravalent dengue virus-like particle vaccine: implication for flavivirus vaccine design. Journal of Virology, 2018, doi:10.1128/JVI.01181-17.
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来自荷兰格罗宁根大学等的科学家们在2018年第35期的《Pharm Res》杂志上发表了题为“Development of a Virosomal RSV Vaccine Containing 3D-PHAD® Adjuvant: Formulation, Composition, and Long-Term Stability”的文章。
文中，使用孔径0.05μm、膜表面积145cm2 聚砜材质MidiKros 中空纤维切向流过滤组件对细胞培养收获的澄清后呼吸道合胞体病毒（RSV）进行切向流超滤浓缩并换液。浓缩的病毒再以凝胶过滤层析纯化。
摘要：目的：鉴定病毒微体，在晚期临床前开发中作为呼吸道合胞体病毒（RSV）疫苗，含膜整合的合成性单磷酰脂质A，3D-PHAD佐剂。方法：病毒微体最初通过含有3D-PHAD的脂质膜与以短链磷脂DCPC溶解的病毒膜的接触而形成，之后进行透析，再将可溶性3D-PHAD加入至病毒膜，或在DMSO中预成形的病毒微体。结果：病毒微体从含有膜糖蛋白G和F以及加入脂质的脂质膜形成，F与G比例与病毒内相似，但浓度稍低，且加入脂质只有一小部分3D-PHAD。通过单颗粒示踪（SPT），病毒微体分布与冷冻电镜所见相似，但动态光散射显示有更大的颗粒。这些结果是由于小病毒微体聚集所导致的。SPT检测显示，病毒微体可稳定达300天。通过DCPC溶解的储液制备佐剂，可增强3D-PHAD在病毒微体中的整合，也可以通过将DMSO溶解的佐剂加入到预成形的病毒微体中。含来自DMSO的0.1mg/mg 3D-PHAD/病毒蛋白的病毒微体可诱导与含有0.2mg/mg DCPC溶解的3D-PHAD的病毒微体相似的抗体滴度。结论：可制备以3D-PHAD为佐剂的稳定RSV病毒微体。
原文：J.Lederhofer, J.van Lent, F.Bhoelan, et al., Development of a Virosomal RSV Vaccine Containing 3D-PHAD® Adjuvant: Formulation, Composition, and Long-Term Stability. Pharm Res, 2018, 35:172.
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来自日本兽医与生命科学大学的科学家们在2017年第98期的《Journal of General Virology》杂志上发表了题为“Intranasal immunization with inactivated feline calicivirus particles confers robust protection against homologous virus and suppression against heterologous virus in cats”的文章。
文中，制备了甲醛灭活的猫杯状病毒（FCV）疫苗。制备时，以CRFK细胞增殖病毒，细胞培养液离心澄清，0.2%甲醛灭活，含病毒的上清液再使用MiniKros中空纤维过滤组件浓缩25倍。
摘要：本文研究了灭活的猫杯状病毒（FCV）疫苗鼻内（IN）给药后对同源或异源FCV感染的保护性效率。猫分组使用实验用灭活的、无佐剂FCV疫苗经IN或皮下（SC）途径免疫后，暴露于同源或高度异源的FCV。IN和SC免疫程序均可建立针对同源FCV感染的稳定保护。尽管两种免疫方案均没有给予针对异源株的保护，但相比SC组，IN组中猫的临床评分和口腔拭子的病毒滴度均较低，且IN组中猫针对异源病毒的中和抗体反应更快。相比SC组，IN组口腔洗液中有更多分泌的、针对FCV蛋白的IgA。使用灭活的完整FCV颗粒进行IN免疫，可为猫提供针对同源病毒暴露的保护，并缩短异源病毒脱落的时间，可作为抗FCV疫苗的一个更好的平台。
原文：H.Sato, G.Sehata, N.Okada, et al., Intranasal immunization with inactivated feline calicivirus particles confers robust protection against homologous virus and suppression against heterologous virus in cats. Journal of General Virology, 2017, 98:1730-1738.
文章摘要为编者翻译，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。