快速、简单且通用的rAAV生产方法
来自美国宾州大学的科学家们在《Human Gene Therapy》杂志发表了题为“Rapid, Simple, and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale”的文章。文章介绍了一种基于HEK293细胞聚乙烯亚胺（PEI）介导转染、切向流过滤浓缩培养上清液、结合碘克沙醇梯度离心的高产量重组腺相关病毒（rAAV）生产工艺。该方法足够简单，不需要过多的特殊技术和设备，可在大多数实验室进行。整个工艺可在1周内完成，且对多种不同AAV血清型通用。经优化后，最终单次运行纯化产物产量可达＞1 x 10^14基因组拷贝数（GC），衣壳蛋白纯度超度90%。以此新工艺进行的载体生产初步试验证实，相比小规模CsCl梯度方法纯化获得的载体，实验获得的载体在体内和体外均具有相当或更好的转导效率。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
背景简介
针对临床基因治疗应用的rAAV的使用正越来越普及，主要是由于rAAV载体在动物模型中长期转基因表达的特性已获证实，且相关毒性较低，此外，在临床前和临床试验中具有良好的总体安全特性。
一个基因治疗药物的开发和最终上市的主要要求是有能力在足够的规模条件下生产基因递送载体。过去，该要求是妨碍rAAV载体成功应用的主要障碍，但近来，已开发了多种兼容大规模临床应用生产的创新型生产系统，但这些系统往往较为复杂，不太适合早期开发和临床前研究，而且此类阶段一般需要评估多种转基因和载体血清型的组合，会形成额外的挑战。
此外，尽管许多基于rAAV的基因治疗项目已在小鼠上进行了临床前研究，但一般认为在大动物上获得的结果更能准确预测实际的临床结果，而大动物研究需要更高的rAAV载体剂量，为满足这些需求，就需要可快速、简单、规模化生产多种测试载体的通用生产系统。
大规模载体生产工艺总结，显示主要工艺步骤和相应的时间线(M.Lock, et al., 2010)。
详细实验操作说明及检测方法，请参考原文。
下游工艺
细胞培养获得的10L培养基料液先以0.5μm 深层过滤器澄清过滤，澄清的料液以切向流过滤方法进行浓缩，使用TangenXTM NovaSet-LS LHV夹具及0.25”管路和端口，配用含MWCO 100kD HystreamTM膜的0.1m2 SIUSTM-LS 一次性使用平板膜包，整个操作过程中TMP维持为10-12psi，料液浓缩125倍至85ml。每次运行后，TFF膜包废弃，系统用0.2N NaOH清洗消毒。
浓缩的料液在15℃条件下以10,500 x g离心20min再次澄清，小心地将上清液转移至一个新管。之后进行碘克沙醇步骤梯度离心，将梯度离心所得馏分混合，使用含有MWCO 100kD HyStreamTM膜的0.01m2一次性使用SIUSTM切向流过滤平板膜包，以最终制剂缓冲液（PBS-35mM NaCl）洗滤10体积，并浓缩4倍至~10ml，整个过程中跨膜压维持为10psi。系统使用最低长度的铂金硫化硅胶管，以使滞留体积最小化。此外，所有料液接触部件使用0.1%的Pluronic F-68预处理2hr，以尽可能降低结合至表面的载体量。每次运行后，过滤器废弃，运行之间，系统以0.2N NaOH清洗消毒。向洗滤浓缩后的产物中加入甘油，终浓度5%，分装并于-80℃储存。
结果
详细结果，请参考原文。
rAAV7下游工艺开发
开发可放大生产工艺的主要目标是维持灵活性，以便使用一种通用的方法，纯化任意的AAV载体。基于密度和大小，从污染物中分离载体的原理适用于不同的载体血清型。这里，实验选择使用切向流过滤，将培养基中的rAAV7浓缩至足够小的规模，以便通过碘克沙醇密度梯度进一步纯化。预澄清使用0.5μm深层过滤器，以去除细胞碎片和贴附的细胞，防止堵塞TFF膜。使用可抛弃型的100kD筛网流道TFF平板膜包、并在整个过程中维持10-12psi的跨膜压，可实现130倍的浓缩。膜的可抛弃型特性避免了运行间的清洗和消毒操作，提高了工艺的可重复性。生产培养基以核酸酶处理，以降低污染性质粒DNA以及细胞性DNA，同时在浓缩前加入500mM盐，以降低载体本身以及与污染性蛋白质的聚集。在下游工艺开发以及全规模中试运行性能测试中，在任意点，都没有观察到由于浓缩过程而造成的载体的显著损失。
大规模中试生产运行收率和产量
为对上述工艺进行合理的表征，并证实在其它AAV血清型上的可重复性和适用性，分别以AAV8和AAV9等进行了全规模的中试生产运行。料液从10L浓缩125倍至85ml，显示无载体损失，而且在几个情况下，浓缩液计算浓度反而有所增高，不过这可能是由于对回流液进行稀释以及qPCR的检测限制所致。而与研发运行相似的，碘克沙醇纯化运行中AAV8和AAV9的收获在35%-50%之间，且AAV6的损失更高。AAV8和AAV9载体的平均总体工艺产量为2.2x1014 GC。
讨论
本实验的目的是开发一种可放大的生产工艺，同时保持其灵活性和简单性，以在标准AAV实验室中，快速生产任何所需的rAAV产品，满足临床前复杂研究的载体需求，特别是大动物试验所需。开发的工艺基于PEI转染，一个主要特点是大部分载体可从培养基中收获，而不是细胞内，从而避免了细胞裂解产生的大量细胞性污染物。上游工艺产量可达2x10^5GC/cell或1x10^15GC/lot。下游工艺选择碘克沙醇梯度离心是为了使工艺可用于所有血清型。碘克沙醇的等渗、相对惰性有利于维持载体的效价以及整体的安全性。切向流过滤浓缩后的料液再以碘克沙醇梯度离心，可在1小时的单步操作中获得高纯度、高效价、产量可接受的rAAV载体，整体工艺快速且经济，且cGMP兼容，所有容器密封，且所有操作在生物安全柜内进行。所以，除了临床前研究，工艺也适用于早期临床研究，特别是对载体剂量要求较低的应用。
离子交换、疏水作用以及亲和层析是从大体积培养基中捕获AAV载体的方法。但是这些方法通常需针对某一AAV血清型开发，所有，对于临床前载体生产，一种可适用于不同血清型的通用方法可能是更好的选择。TFF浓缩/碘克沙醇梯度离心方法是一种rAAV纯化的通用型下游方法，且实验证实，获得的载体纯度较高，且基本无空颗粒。TFF浓缩步骤的一种替代方法是使用硫酸铵或PEG，从上清液中沉淀载体。但是这两种方法都需要对大体积的上清液进行离心，这对于硫酸钠来说更加更难，因为沉淀AAV需要高达50%的饱和度。此外，据我们经验，PEG沉淀会影响AAV载体效价。而使用TFF，浓缩过程可在2hr内完成，且TFF工艺的另一个优势是，较小的蛋白质会通过过滤膜，起到额外的纯化功能。
总结来说，原文介绍的rAAV载体纯化工艺旨在满足进入临床前试验的实验室对AAV载体的需求，特别是对灵活生产平台的临床前需求。通过适当的优化，该工艺也可为临床应用提供所需的rAAV载体，同时维持现有的优势，如简化试剂使用、工艺速度以及去除载体特异性杂质。
原文：M.Lock, M.Alvira, L.H.Vandenberghe, et al., Rapid, Simple, and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy, 2010, 21:1259-1271.
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
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