端到端整合式连续生物生产工艺的中试规模验证
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简介
生物药商业化生产的当前标准是在大型、集中式不锈钢设备中使用批次工艺进行。与其它行业类似，生物药生产也在从批次工艺向整合式、连续工艺过渡。从传统的批次工艺到整合式连续生物生产的过渡预计会产生许多好处，包括降低资金和运营成本；通过工艺强化提高产量并减小设施规模；支持多产品“宴会厅”设施生产；提高灵活性，以应对不断变化的需求；提高产品质量的一致性。这些好处的最终结果将是有可能大大改善挽救生命的生物药的可获得性，包括在一些欠发达地区，这些国家的患者目前受到的医疗服务严重不足。
过去几年，在整合式连续生物工艺(ICB)的实现技术方面取得了多项重大进展。特别是，生产生物反应器与一个或多个连续层析步骤以及低pH病毒灭活的整合已经达到了技术成熟阶段，一些公司正转向使用这些混合型ICB系统进行临床和商业化生产。这种转变得到了多种经济分析的支持，这些分析证明了混合连续工艺的价值。然而，除病毒过滤和最终超滤/洗滤操作的整合在文献中还较少报道。造成这一差距的原因可能有多个方面，包括对除病毒过滤器长时间操作的担忧，以及缺乏适合的单次通过洗滤(SP-DF)技术。这些单元操作的整合将使一个真正的端到端药物底物生产系统成为可能，并有可能进一步降低生产设施的规模和成本。
基于之前的证实实验，在本研究中，以单抗作为模式蛋白，我们描述了一种中试规模、端到端整合式连续药物底物生产系统的概念验证。该系统整合了典型单抗药物底物工艺的所有单元操作。如下图所示，这个整合的工艺包括灌流生物反应器、多柱捕获和精制层析、低pH病毒灭活、除病毒过滤、超滤、洗滤、制剂(添加赋形剂)以及除菌过滤。关键的设计目标集中在自动化、工艺封闭、连续操作和工艺规模，并将其纳入到工艺设计当中，以确保这一概念验证为未来GMP系统的设计和实施提供有用信息。这些设计目标的重点如下表所示，并应用于单个单元操作以及整个系统。这里描述的概念验证的结果标志着整合式连续生物工艺的开发和实施向前迈出了重要的一步。
本研究中端到端连续工艺的示意图。每个单元操作物理性整合，且产物从一个单元连续流入下一个单元。整个工艺包括整合交替式切向流（ATF）设备的100L 一次性使用生物反应器（SUB）、Protein A多柱层析（MCC）、低pH灭活（VI）、精制MCC、除病毒过滤（VF）、超滤（UF）、洗滤（DF）以及制剂。
端到端连续工艺验证的设计目标
类别 | 设计目标 |
自动化 |
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封闭式 |
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连续 |
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工艺规模 |
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材料和方法
连续工艺系统：本研究的端到端工艺组成包括灌流生物反应器（BRX）、多柱层析（MCC）、在线病毒灭活（VI）、除病毒过滤（VF）、超滤（UF）和洗滤（DF）、在线制剂以及最终过滤以生成药物底物。
整合和封闭：所有单元操作物理性整合，并控制流速，以确保系统中没有质量或体积性累积。作为概念验证期间的额外预防措施，在整个系统中设置了多个缓冲罐，以稳定任何暂时性的流速波动，并留出时间以对工艺干扰作出反应。在以下操作之间设有缓冲罐：生物反应器和捕获层析、捕获层析和病毒灭活、病毒灭活和精制层析、精制层析和除病毒过滤以及除病毒过滤和超滤之间。
为确保工艺封闭，所有与产品接触的材料都进行了灭菌(通过伽玛辐照或高压灭菌)、在线蒸汽灭菌（SIP）或在安装前消毒。Protein A (ProA)层析柱以伽玛辐照灭菌。尽可能减少仅消毒部件的使用。各部件灭菌或消毒后，所有连接均采用无菌焊接。
细胞培养：本研究的目标分子通过在100 L灌流生物反应器(BRX)中表达重组IgG的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的培养生产。灌流生物反应器整合交替式切向流 (ATF）系统(Repligen)。在捕获层析之前，无细胞、含产物的收获液收集在一个整合的缓冲罐中。
层析：在2 × 1 L MabSelect Sure (MSS) Protein A (ProA) 层析柱(Cytiva)上连续捕获含有产物的收获液。两根层析柱以结合-洗脱模式平行操作，收获液连续流入两根层析柱中的一根。层析柱切换基于3% 流穿的ΔUV信号。
病毒灭活后，使用装填Capto Adhere和Capto Phenyl填料(Cytiva) 的0.2 L (5 × 20 cm) OPUS 预装层析柱(Repligen) 进行精制层析，以流穿模式操作。Capto Adhere 流穿直接上样到Capto Phenyl柱，没有步骤间调整。两组Adhere/Phenyl层析柱链平行操作，病毒灭活的物料连续流向两组柱链中的一组。精制层析柱安装如下图所示。层析柱切换基于ProA操作的节奏，两个ProA循环耦合一个Adhere/Phenyl循环。
所有层析操作都在中试规模、在线蒸汽灭菌(SIP)、四柱位周期性逆流层析(PCC)系统(Cytiva)上进行的。MSS柱占据了四柱中的两个位置，而另外两个位置为Adhere/Phenyl柱对。
病毒灭活：请参考原文
除病毒过滤：请参考原文
超滤和洗滤（UF/DF）：除病毒过滤器（VRF）的输出液用0.065 m2 30 kDa Cadence Inline Concentrator (Pall) UF膜包浓缩。使用FlowVPE （C Technologies）进行在线浓度检测，通过PID反馈回路控制UF阶段的出口产品浓度。UF 膜包的流出液随后使用SP‐DF膜包(Sartorius原型产品，30 kDa)换液至醋酸缓冲液。通过控制洗滤缓冲液和产物的相对流速来维持目标DF比。
制剂和最终过滤：请参考原文
分析方法：使用内部分析方法进行蛋白质浓度、宿主细胞蛋白(HCP)、高分子量物质(HMW)、残留Protein A (rProA)、纯度和电荷异构体分布的定量。产物浓度使用SoloVPE（C Technologies）以在280nm处的吸光度测定。rProtA和HCP采用ELISA法定量。使用TSK-Gel G3000SWXL柱(Tosoh)以HPLC-SEC检测HMW水平。使用十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)方法，在非还原(NR)条件下，检测纯度。电荷异构体分布通过毛细管等电聚焦(cIEF)方法确定。使用药典方法测定pH、渗透压和生物负荷。
工艺监测：使用一次性使用超声波流量计(Levitronix)监测工艺流速。使用一次性使用压力传感器(Pendotech)监测压力。使用在线pH计(Hamilton)监测VI液流的pH值。使用在线紫外吸光度传感器和光度计(Pendotech)监测VI液流的蛋白浓度。层析操作的pH值、电导率和紫外吸光度通过PCC系统上各自的内置传感器进行监测。通过使用FlowVPE (C Technologies)以280 nm处的吸光度监测UF液流中的蛋白浓度。
控制和数据管理：所有层析单元操作均使用UNICORN软件进行控制。非层析单元操作(VI、VRF、UF/DF和制剂)的控制通过DeltaV分布式控制系统(Emerson)实现。所有在线传感器和工艺数据都收集并存储在PI数据历史器(OSIsoft)中。
结果与讨论
工艺整合概况。(a)各个单元操作的启动时间和持续时间。(b)在每个单元操作中的平均产物滞留时间。
层析操作结果总结。(a)多柱ProA操作示意图。(b) ProA运行7天的UV层析图谱快照。(c)每五个ProA洗脱峰的图谱叠加。洗脱峰拖尾的变化证明了洗脱缓冲中的工艺干扰。(d)多柱精制操作示意图。(e)精制柱运行7天的UV层析图谱快照。(f)精制层析柱每五个循环的流穿峰叠加。
整体工艺性能和中间体质量总结。(a)每个单元操作的质量通量随时间的趋势。DS生成的25天期间的平均质量通量显示为图中的水平虚线以及图右侧。此外，还给出了平均操作回收率.。平均整体工艺回收率为~70%，与该分子批次纯化工艺的预期值一致。(b)不同单元操作的产物浓度、宿主细胞蛋白、残留ProA和HMW随时间的变化趋势。
6个药物底物批次的产品质量总结。单个批次的值显示为点，接受水平用虚线表示。所有批次的pH值、纯度、电荷分布、HCP和HMW满足接受水平。某几个批次中产物渗透压出现偏差的原因在于在制剂操作中，很难将流速比一致地维持在极低的水平，从而导致终产物中糖浓度的差异，这也部分解释了浓度出现差异的原因。
详细实验结果，请参考原文。
工艺强化
上述工艺在25天内生产了约5 kg药物底物，平均产量为200 g/day (2 g/L BRX/day)。根据这一产量推算，一个充分利用这一工艺的生产工厂(100 L 灌流生物反应器)预计每年可以生产约100 kg的药物底物。假设生物反应器的滴度为5 g/L，充分利用的1000 L传统补料分批工厂才可产生大致等量的药物底物。下表中列出了补料分批工艺和本工艺的设备尺寸比较。
本验证实验中ICB工艺与相当产量（~100 kg DS/year）的补料分批工艺的单元操作规模比较
设备 | 补料分批工艺 | ICB工艺 | 降低倍数 |
生物反应器 | 1000 L | 100 L | 10x |
收获罐 | 1000 L | 100 L | 10x |
捕获层析柱 | 25 L | 2 x 1 L | 12.5x |
中间体罐（x4） | 500 L | 5 L | 100x |
VI罐 | 500 L | 5 L | 100x |
精制层析柱 | 2 x 5 L | 4 x 0.2 L | 12.5x |
除病毒过滤器 | 1 m2 | 0.5 m2 | 2x |
UF/DF膜 | 5 m2 | 0.5 m2 | 10x |
总罐体积 | 4500 | 220 | ~20x |
如表中所示，ICB工艺的设备和罐的尺寸都有明显的减小，从VRF的2倍到工艺中间体罐的100倍不等。相对于补料分批工艺，ICB工艺的总罐体积减少了约20倍。该分析没有考虑缓冲罐的体积，其体积取决于缓冲液制备/输送策略，对于每种工艺来说，均会因为处理的类型或相关配套设备(如水电、泵、HVAC等基础设施)的规模而变化。但即使从这个简单的分析中也可以清楚地看出，ICB工艺可以在实质上更小的占用空间中生产同等量的药物底物。
总结
我们在此提出了一个成功的概念证明，用于单抗的整合式端到端连续中试规模药物底物生产工艺。该工艺整合了单抗生产工艺中常见的所有单元操作，包括最终的除病毒过滤、UF/DF和制剂操作。该概念验证工艺的设计理念包括：高度自动化，最大限度地减少操作人员的交互；封闭的系统(在可行的情况下)，以在多产品的“宴会厅”空间内操作；产品从生物反应器到药物底物的连续流动，过程中滞留时间最小化；在GMP实施前进行中试规模操作，以识别潜在的失败模式。从生物反应器到制剂的药物底物，整个连续系统共整合运行了25天，并成功生产了4.9 kg的药物底物。从生物反应器到连续的除病毒过滤的整合总共达到37天。在整个运行过程中，产品质量一致，符合试验分子的放行规格，但产品浓度和渗透压因制剂操作不一致而有所变化。
虽然这一概念验证是成功的，但也发现了一些未来可优化的机会点。最重要的机会将是优化对最终制剂操作的控制。由于最终产品液流的低流速，很难依靠目前可用的流量传感器和泵来确保正确的赋形剂添加。另一个未来的优化点是在整个过程中更广泛地应用过程分析技术，既用于过程监控，也用于提高控制的稳健性。最后一个优化的机会是转向基于预灭菌(不只是消毒)工艺设备的100%一次性使用系统，以允许工艺真正地“封闭”，而不只是功能性封闭。
除了优化的机会外，在该系统用于商业化生产之前，可能还需要解决若干差距。这些差距包括：更小规模的封闭式纯化设备的可用性；流量计在极低流量条件下的可靠性；跨多个整合单元操作整合控制原件；以及处理规格异常物料的策略。尽管存在这些差距，但本研究证明，利用现有的工艺技术，在中试规模上实现端到端整合式连续单抗生产工艺是可行的。这标志着在实现ICB工艺商业化的道路上取得了重要成就，而实现了这一转变可带来重大利益。
原文：M.J.Coolbaugh, C.T.Varner, T.A.Vetter, et al., Pilot‐scale demonstration of an end‐to‐end integrated and continuous biomanufacturing process. Biotechnologies & Bioengineering, 2020, DOI: 10.1002/bit.27670.
使用SoloVPE/FlowVPE进行快速、可重复且更准确的蛋白质浓度检测
XCell ATF® 细胞截留装置简介
OPUS® 预装层析柱简介
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